Damos las gracias a Wendy salmón y Nicki Watson de la instalación Keck en el Instituto Whitehead del MIT para la formación de imágenes.

1. Preparación de DC2.4 y RAW 264.7 Líneas Celulares NOTA: La línea celular similar a macrófagos RAW 264.7 y la DC2.4 línea de células dendríticas son tanto de origen murino, y se utilizaron las siguientes condiciones para cultivar las células. <ol><li> Crecer células RAW 264.7 en DMEM (medio de Eagle Mínimo de Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2. </li><li> Se cultivan las células DC2.4 en condiciones similares con la de las células RAW 264.7, salvo el uso del medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado con L-glutamina en lugar de DMEM. </li></ol> 2. Preparación de conjugados fluorescentes Partículas: Perlas de C. albicans, zimosán, recubiertas de IgG- <ol><li> Cultivo de Candida albicans <ol><li> Inocular C. albicans cepa SC5314 de un stock de glicerol congelado en 25 ml de YPD suplementado con Uri (2% Bacto-peptona, 1%extracto de levadura, 2% de glucosa y 80 mg / ml uridina) durante la noche a 30 ° C. NOTA: Evitar crecer el cultivo de Candida más de una DO 600 de 12. </li><li> Tomar 1 ml de la C. albicans y girar hacia abajo a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento con 1 ml de PBS. </li><li> Recoger el precipitado por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Repita el paso 2.1.4. </li><li> Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de C. albicans en relación con el número de fagocitos y proceder con el ensayo de fagocitosis tal como se describe en la sección 3. Un OD 600 de 1 es equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans por 1 ml. NOTA: Generación de Candida-BFP se describe en la referencia 13. </li></ol></li><li> Preparación de zimosán y perlas recubiertas con IgG NOTA: Zymosan es una que contiene β-glucano-preparación de partículas de hidratos de carbono por hongos que deriva de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan se conoce para evocar señales inflamatorias en los macrófagos y las células dendríticas, y se ha utilizado ampliamente en estudios de fagocitosis 13, 14, 15. <ol><li> En resumen vórtice del tubo que contiene el material en partículas, y la alícuota una cantidad suficiente para un experimento en un tubo de 1,5 ml. NOTA: Por lo general usamos relación 1:10 (para una celda, añadir 10 zymosan partículas o perlas recubiertas con IgG). </li><li> Añadir 1 ml de PBS enfriado en hielo, y recoger las partículas por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS 1 ml de hielo-frío. </li><li> Repita los pasos 2.2.2-2.2.3 NOTA: Continúe con el punto 2.2.5 o almacenar el tubo a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Sonicar las partículas de 10 seg en baño de ultrasonido ultrasónico (120 V, 50 a 60 kHz) con el fin de evitar unany la agregación de partículas. </li></ol></li></ol> 3. La fagocitosis NOTA: La fagocitosis es un proceso complejo que se inicia con la unión de las partículas en la superficie celular de los fagocitos a través de la interacción de PRRS con ligandos sobre la superficie de la partícula. La unión es seguido por el montaje de actina y sus proteínas asociadas en el sitio de contacto, y la formación de una taza de fagocitosis. El desmontaje posterior actina se produce en el fagosoma y da lugar a la inmersión completa de las partículas. A continuación se describen las diferentes etapas de la fagocitosis. <ol><li> Ensayo de unión NOTA: La finalidad de este experimento es para controlar la primera etapa de la fagocitosis que implica la interacción entre los ligandos sobre las partículas diana y los receptores en los fagocitos. <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alterntivamente, células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 ó 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de cristal. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. </li><li> Colocar el portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 min. </li><li> Retire con cuidado el medio de cada pocillo usando una pipeta o un aspirador. PRECAUCIÓN: Realice este paso cuidadosamente como cada pocillo de un sistema de cámaras cubreobjetos es pequeño; es fácil de perturbar las células con la punta de una pipeta o un fuerte flujo de aire de un aspirador. </li><li> Mezclar las partículas marcadas con fluorescencia con un medio de cultivo celular (preparado como se ha descrito anteriormente). Añadir Candida -BFP (a una MOI de 10), con fluorescencia perlas-conejo-zymosan conjugado o látex IgG-FITC (10 partículas por célula) a las células. Utilizar un volumen final de 200 l medios de comunicación para una cámara bien para asegurar que todas las células están cubiertos. </li><li> Girar por el tobogán de cámara en 277xg durante 3 min a 10 ° C. NOTA: Este paso de centrifugación ayuda a aumentar el contacto entre las partículas y las células, y se sincroniza el proceso de unión. </li><li> Transferir inmediatamente la diapositiva cámara a un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO2 durante 5 min. </li><li> Retire la diapositiva cámara de la incubadora y aspirar los medios de comunicación. </li><li> Se lavan las células 3 veces con PBS helado. NOTA: Compruebe la presencia de partículas sueltas con un microscopio óptico y se lava varias veces con PBS, si es necesario. Es esencial para eliminar las partículas no unidas del pozo para minimizar el ruido de fondo durante el análisis. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS mediante incubación durante 30 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Este paso requiere el uso de PFA al 4%, que es altamente tóxico, corrosivo, y carcinógeno potencial. Adecuada se debe tener cuidado al usar este líquido. Además, proteja las muestras de la luz. </li><li&gt; Lavar las células mediante la adición de 500 l de PBS en la cámara y aspirar la solución suavemente. </li><li> 3.1.9 Repita el paso dos veces. NOTA: En este paso, vuelva a llenar cada vial inmediatamente después de retirar el PBS anterior. </li><li> Detener la fijación mediante la incubación con 500 l de 50 mM NH 4 Cl en PBS durante 10 min. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10. </li><li> Permeabilizar las células mediante la adición de 250 l de tampón de unión (0,1% de saponina, 0,2% de BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Manchas F-actina mediante la adición de faloidina conjugada con fluorescencia (diluido 1: 500 en tampón de unión). Se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10. </li><li> Capturar imágenes utilizando un microscopio confocal (objetivo 63X y 402 nm y 488 nm láser) y analizar las imágenes usando ImageJ 16. NOTA: La unión Una partícula éxito se caracteriza por la presencia de un cu fagocíticap en el lugar donde el contacto de partículas de la célula fagocítica (Figura 1). Vea el paso 3.2.5. </li></ol></li><li> La fagocitosis Ensayo de absorción NOTA: Este experimento está diseñado para controlar la internalización completa de las partículas marcadas con fluorescencia por los fagocitos usando microscopía confocal (Figura 2). <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alternativamente, las células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 o 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de vidrio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. </li><li> Mantenga los portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 minutos. NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la endocitosis, así como la fagocitosis no deseado y, posteriormente, tener un fagocitosis sincronizada. </li><li> perfORM pasos de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> La transferencia de la diapositiva cámara a un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2, y se incuba durante diferentes puntos de tiempo. Fijar las células después de la infección 30, 60 y 90 minutos después. Observe C. albicans se empiezan a formar hifas después de la infección de 60 minutos; fagocitos comienzan a mostrar la muerte celular (pyroptosis) después de 90 min 8. NOTA: Esta es una recomendación, y la optimización es esencial en función del tipo de células y el material en partículas utilizado. </li><li> Realice los pasos de 3.1.7 a 3.1.15. Analizar las imágenes usando ImageJ 16. NOTA: una absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de un material en partículas en el interior del citoplasma de un fagocito (Figura 2). La tinción de los fagocitos con marcador de superficie celular tales como faloidina ayuda a delinear el contorno de las células. También es esencial para llevar a cabo z-pilas con el fin de determinar si el material en partículas se une a la superficie celular o completely internalizado. </li></ol></li><li> Imágenes en vivo de la fagocitosis NOTA: En este protocolo se describe el uso de la microscopía confocal para capturar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando zymosan fluorescente conjugado. Nosotros usamos la línea de células dendríticas DC2.4 que expresa de forma estable etiquetada con mCherry F-actina 8, un biosensor que muestra la distribución de actina filamentosa en las células vivas. Desde la fagocitosis es un proceso actina impulsado por la formación de imágenes en vivo en esta celda no sólo nos permite capturar el movimiento y la dinámica de la red de F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticas dentro de las células vivas (Figura 3, Película 1). <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, a una concentración de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o unatécnica similar. </li><li> Mantener los portaobjetos de cámara en hielo durante 10 min. NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la absorción no deseada, y tener una fagocitosis sincronizada. </li><li> Realice los pasos de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Pre-calentar la platina del microscopio a 37 ° C y equilibrar la cámara con 5% de CO 2. Espere 30 a 45 min para la temperatura y el CO 2 para estabilizar antes de iniciar la formación de imágenes. NOTA: Dado que las emisiones de CO 2 y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, es importante para encender el calentador de microscopio antes del experimento para equilibrar la cámara ambiental. </li><li> Colocar el portaobjetos cámara que contiene las células en el recinto microscopio incubador equilibrado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Realizar las imágenes en directo 17, 18. NOTA: Los ajustes de la potencia del láser (ganancia, agujero de alfiler, etc.) puede variar dependiendo del tipo de THe microscopio y la sonda fluorescente usada. Por lo tanto, se recomienda consultar el manual del microscopio para la condición óptima para su imágenes en vivo 17,18. <ol><li> Utilice microscopio láser confocal de barrido (y el software asociado) para imágenes en vivo. Utilice petróleo objetivo 63X 1.4NA con un agujero de alfiler de 1-1.1 unidades Airy. </li><li> Para iniciar la proyección de imagen, se utiliza el campo brillante para encontrar una región representativa en la diapositiva cámara. A continuación, seleccione el campo haciendo clic en la opción de posición sobre el software. Para detectar las buenas prácticas agrarias en la pista 1 utiliza el conjunto de filtros de 488 nm láser con un divisor de haz a 582 nm, para detectar longitudes de onda entre 488 y 582 nm. </li><li> En la pista 2 seleccionar un conjunto de filtros óptima para mCherry (RFP), utilizando un divisor de haz a 578 nm y la detección de longitudes de onda entre 578 y 600 nm. Utilice 488 nm y 578 nm con láseres de potencia del láser 50% y una salida de ganancia de 600-700. Obtener imágenes cada 30 seg durante un total de 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Janeway, C. A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition.">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li><li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+during+phagocytosis.">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+macrophage+&amp;#34;probing&amp;#34;+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets.">Dynamic macrophage &amp;#34;probing&amp;#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li><li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis.">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li><li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans.">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).</li><li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+cholesterol,+lateral+mobility,+and+the+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin.">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li><li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis.">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li><li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li><li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton's+Tyrosine+Kinase+(BTK)+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages.">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance.">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li><li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages.">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li><li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering.">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li><li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+host-Leishmania+interactions:+significance+in+visceral+leishmaniasis.">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li><li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii.">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

fagocitos profesionales, como los macrófagos y las células dendríticas, envolver y eliminar los patógenos invasores por lo tanto haciendo la fagocitosis un componente importante del sistema de defensa del huésped. Durante este proceso se someten a los fagocitos extensa reorganización de la membrana y la reorganización del citoesqueleto en su superficie celular 8, 19, 20. Para entender mejor este proceso dinámico, la vis...

A pesar de la continua exposición a patógenos tales como bacterias, virus y hongos, nuestro cuerpo está bien equipado con mecanismo inmunológico que proporciona protección frente a la infección. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra los patógenos invasores y se basa principalmente en las células fagocíticas que reconocen y se internalizan objetivos extranjeros. La fagocitosis es un proceso celular evolutivamente conservada que abarca la inmersión de las partículas no deseadas de más de 0,5 micras. Las células fagocíticas expresan una amplia gama de receptores inmunes (también conocidos como receptores de reconocimiento de patrón, PRRS) en la superficie celular que les permiten reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) presentes en los patógenos antes de la inmersión 3. La unión de patógenos es seguido por la agrupación de receptores en la superficie celular y provoca la formación de una taza fagocítica. Esto da lugar a la remodelación de la membrana actina guiado que sobresale alrededorel objetivo, finalmente, que la envuelve y pellizcos-off para formar una vacuola phagosomal discreta 2, 5. El fagosoma continuación, madura y se acidifica mediante fusión posterior con los endosomas tardíos y lisosomas que forma fagolisosómica 6. Aunque se describe como la fagocitosis mediada por el receptor de eventos y actina impulsado, este proceso también se basa en la modificación espacial-temporal de los lípidos que componen la membrana de plasma, tales como fosfoinosítidos (IP) y esfingolípidos 7, 8. Mientras que la polimerización de actina es dictada por una acumulación local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) en la base de la copa fagocítica, despolimerización de la actina depende de la conversión de (PI (4,5) P 2 a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Ambas modificacionesson esenciales ya que el primero lleva a la extensión de los seudópodos alrededor del objetivo y éste permite el hundimiento de las partículas en el citosol de la fagocitos 10. Las células que tienen la capacidad de fagocitar o son fagocitos profesionales, como macrófagos / monocitos, granulocitos / neutrófilos, y células dendríticas (DC) o fagocitos no profesionales, tales como fibroblastos y células epiteliales 11. La fagocitosis realizada por todos los fagocitos juega un papel central en el mantenimiento del tejido y remodelación, mientras que la fagocitosis realizada por fagocitos profesionales se encarga de la coordinación de la respuesta inmune innata y adaptativa frente a los patógenos. fagocitos profesionales no sólo engullen y matan el patógeno, sino también los antígenos presentes en las células linfoides del sistema inmune adaptativo. Esto contribuye a la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y para la participación de las células linfoides, por lo tanto, conduce ael bloqueo con éxito de la infección 12. técnicas bioquímicas convencionales han sido fundamentales en la obtención de conocimientos sobre el mecanismo molecular de diferentes procesos celulares durante la fagocitosis, tales como las modificaciones posteriores a la traducción y diversas asociaciones de alta afinidad entre proteínas. Sin embargo, es difícil obtener información con respecto a la dinámica espacial y temporal de los acontecimientos fagocíticas utilizando los métodos bioquímicos convencionales. imágenes de células vivas no sólo nos permite supervisar eventos celulares en cuenta la sensibilidad de tiempo sino que también nos permite obtener información a nivel de células individuales. Aquí se describe un método para investigar las diferentes etapas de la fagocitosis, así como analizar todo el proceso espaciotemporalmente usando microscopía confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="988">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:253px;">AppliChem</td>
			<td style="width:332px;">A1108</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td>9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP-231-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Minimal Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">FITC-coupled IgG-coated latex beads</td>
			<td style="width:253px;">Cayman</td>
			<td style="width:332px;">500290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-streptomycin (10&#39;000U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;"><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Phalloidin-Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RAW 264.7 cells</td>
			<td style="width:253px;">ATCC</td>
			<td style="width:332px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (1X) (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;85114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Zymosan-Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">Z23374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the early stages of phagocytosis

El cuerpo de los mamíferos está equipado con varias capas de mecanismos que ayudan a defenderse de las invasiones de patógenos. Fagocitos profesionales del sistema inmune - como los neutrófilos, células dendríticas y macrófagos - conservan la capacidad innata para detectar y borrar dichos patógenos invasores a través de la fagocitosis 1. La fagocitosis implica eventos coreografía de reorganización de la membrana y la remodelación de la actina en la superficie celular 2, 3. Los fagocitos interiorizan con éxito y erradicar moléculas extrañas que se hayan cumplido todas las etapas de la fagocitosis. Estos pasos incluyen reconocimiento y unión del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reside en la superficie celular, la formación de la taza de fagocitosis a través de protuberancias membranosas de actina enriquecido (seudópodos) para rodear el material en partículas, y la escisión del fagosoma, seguido de maduración fagolisosoma que resultados en lamatando del patógeno 3, 4. Imaging y cuantificación de las diversas etapas de la fagocitosis es instrumental para elucidar los mecanismos moleculares de este proceso celular. El presente trabajo reporta métodos para estudiar las diferentes fases de la fagocitosis. Se describe un enfoque basado en microscopio para visualizar y cuantificar la formación de una copa de unión, fagocítica, y la internalización de partículas por los fagocitos. Como la fagocitosis se produce cuando los receptores innatas en las células fagocíticas encuentran ligandos sobre una partícula objetivo más grande que 0,5 m, los ensayos que aquí presentamos comprender el uso de hongos patógenos Candida albicans y otras partículas tales como zymosan y perlas recubiertas con IgG.

se presenta método basado en microscopio para controlar las diferentes etapas de la fagocitosis. Se muestran los diferentes eventos durante la fagocitosis de partículas fluorescentes diferentes de células DC2.4. Usando las técnicas descritas aquí, se investigó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis. Para este propósito, las células dendríticas DC2.4 genéticamente deficientes en Sptlc2, la enzima que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la ruta de biosíntesi...

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K vistas.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Video: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Capas de Simbiosis - Visualización del intestino posterior, las termitas de la comunidad microbiana

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Investigación

Biología

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

La disección y análisis de aguas abajo de Zebra Finch embriones en etapas tempranas del desarrollo

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution of specific genes to brain development and function increases. Relying on mouse models to study the role of specific genetic manipulations is not always feasible since transgenic mouse lines are quite costly and many novel disease-associated genes do not yet have commercially available genetic lines. Additionally, it can take years of development and validation to create a mouse line. In utero electroporation offers a relatively quick and easy method to manipulate gene expression in a cell-type specific manner in vivo that only requires developing a DNA plasmid to achieve a particular genetic manipulation. Bilateral in utero electroporation can be used to target large populations of frontal cortex pyramidal neurons. Combining this gene transfer method with behavioral approaches allows one to study the effects of genetic manipulations on the function of prefrontal cortex networks and the social behavior of juvenile and adult mice.

The role of recently discovered disease-associated genes in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders remains obscure. A modified bilateral in utero electroporation technique allows for the gene transfer in large populations of neurons and examination of the causative effects of gene expression changes on social behavior.

Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...