Este estudio se llevó a cabo en cooperación con el Proyecto Nacional de bio-recursos, el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón.

El esquema general del experimento se muestra en la fig. 1. 1. Preparación de los reactivos <ol><li> Hacer que el medio de base (en este caso en la conocida como PB1) en una botella de vidrio de 100 ml de acuerdo con la siguiente tabla a continuación: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 .12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td&gt; glucosa </td><td> 180,2 </td><td> 5.56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> La penicilina G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (aprox) </td></tr></tbody></table></li><li> Hacer que el Ficoll-sacarosa (FS): Se <ol><li> Añadir las siguientes sustancias químicas a 14 ml de PB1 solución en un tubo de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mezcla de Ficoll 70 y sacarosa en PB1 solución y agite bien hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Después de comprobar la completa disolución anterior, agregue la BSA sobre la superficie de la solución y mantenerla a4 ° C hasta que se disuelva por completo BSA (&gt; 4 horas o toda la noche). </li></ol></li><li> Hacer que la solución de equilibrio (EFS20) y la solución de vitrificación (EFS40) en un tubo de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) de glicol de etileno, 24% (w / v) Ficoll, y 0,4 mol / L de sacarosa en PB1 con BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) de glicol de etileno, 18% (w / v) Ficoll, y 0,3 mol / L de sacarosa * en PB1 con BSA * Para los embriones de la cepa BALB / c o ICR, aumentar la concentración de sacarosa de 0,9 mol / L de sacarosa, ya que son más sensibles a cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solución </td><td> EFS40 solución </td></tr><tr><td> Etilenglicol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS solución </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Esterilizar la solución por filtración con un 0,45 micras filtranter. Hacer alícuotas en tubos de 5 ml de poliestireno y se almacenan a 4 ° C. Se pueden utilizar durante unos 6 meses. </li><li> Preparación de la solución de descongelación de embriones que contiene 0,75 M de sacarosa (TS1) <ol><li> Disolver 7,7 g de sacarosa en PB1 (preparado en el paso 1.1) y un volumen total de 30 ml. Mezclar por agitación suave hasta que la sacarosa se disuelva por completo. </li><li> Añadir 90 mg de BSA sobre la superficie de la solución y dejar reposar hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Esterilizar la solución por filtración. </li><li> Alícuota y almacena a 4 º C. Pueden ser utilizados por cerca de un mes. </li></ol> Nota: TS1 también puede ser preparado a partir de M2 ​​disponibles en el mercado. <ol start="6"><li> Disolver 7,7 g de sacarosa en la M2 y un volumen total de 30 ml. </li><li> Mezclar por agitación suave hasta que la sacarosa se disuelva por completo. </li><li> Esterilizar la solución por filtración. </li><li> Alícuota y almacena a 4 ° C. Pueden ser utilizados por cerca de un mes. </li></ol></li><li> TS2 (solución de descongelaciónque contiene 0,25 M de sacarosa): <ol><li> Diluir 10 ml TS1 con un volumen de 20 ml de PB1 o M2, según el caso. </li><li> Alícuota y almacena a 4 º C. Pueden ser utilizados por cerca de un mes. </li></ol></li></ol> 2. La vitrificación de embriones de ratón de 2 células <ol><li> Prepare dos células de embriones de ratón en el apareamiento natural o convencional en las técnicas de fertilización in vitro. </li><li> Alícuota de 50 l EFS40 en un criotubo. En lo sucesivo, lleve a cabo el resto del procedimiento de vitrificación en la temperatura ambiente. </li><li> Alícuota de 50 l de EFS20 en la parte inferior de 35 mm o 60 mm plato de plástico Petri. </li><li> De transferencia de hasta 30 embriones a EFS20 con un capilar de vidrio con sólo la cantidad mínima de medio de cultivo. Iniciar un temporizador de dos minutos. Nota: Coloque los embriones en la parte inferior de la gota. Esto hace que la deshidratación eficiente de los embriones. Compruebe la morfología de los embriones de un microscopio estereoscópico. Embriones deshidratados muestran una morfología encogido, como se muestra en la fig. 2A.Si no está deshidratado bastante, esperar más 1 o 2 minutos. </li><li> En alrededor de 1,5 min, recoger los embriones a partir de la caída de EFS20 con sólo la cantidad mínima de la solución. Transferirlos a EFS40 en el criotubo preparado en 2,1 paso. Nota: Para obtener los mejores resultados, ajustar el tiempo de recoger los embriones a fin de que todos los embriones pueden ser transferidos a EFS40 en torno a 2 min. </li><li> Esperar durante 1 minuto. </li><li> Ponga el criotubo directamente en nitrógeno líquido (LN 2). </li></ol> 3. Descongelación vitrificados de 2 células de embriones de ratón <ol><li> Antes de descongelar, preparar un plato con 10 gotas l de medio de cultivo de embriones embriones recuperados (véase el paso 3.13). Cubra el plato con aceite y colocar en una incubadora de CO 2 hasta su uso. Nota: Aunque los medios de comunicación para el cultivo de embriones de rutina puede ser utilizado en este experimento, le recomendamos que los medios de comunicación con mayor osmolaridad, como medio de M16. </li><li> TS1 caliente a 37 ° C. </li><li> Ponerse una máscara de la cara y cryogloves. Abra la LN 2 tank y recuperar un criotubo con embriones. </li><li> Abrir rápidamente la parte superior del tubo y desechar LN 2. Espere 30 segundos para evitar TS1 de la congelación en el próximo paso. </li><li> Utilice una pipeta 1000ul añadir 850 l de TS1 (37 ° C) en el tubo y mezclar la solución de pipeteados suave (alrededor de diez veces en 25 segundos) hasta que la solución es uniformemente disuelto. </li><li> Transferencia de la totalidad del volumen del tubo de plástico a un plato de Petri de 60 mm (o un vidrio de reloj) (Fig. 3). Nota: Los embriones deben ser manejados a temperatura ambiente (22-25 ° C) hasta que se colocan en una incubadora de CO 2 en el paso 3.14. </li><li> Iniciar un temporizador de 3 minutos. </li><li> Alrededor de 2 minutos en TS1, agite suavemente el plato hasta que el medio que contiene los embriones se extiende sobre la superficie de la placa (Fig. 3B). Nota: Esto ayudará a los embriones de ir hasta el fondo, ya que están flotando cerca de la superficie cuando se transfiere a TS1. </li><li> Poner tres gotas de 50 l de TS2 en the plato (Fig. 3C). </li><li> Después de 3 minutos en el TS1, comprobar la morfología de los embriones de un microscopio estereoscópico, sino que debe ser un poco encogido. Ver la morfología de los embriones en las primeras (Fig. 2B) y posterior (Fig. 2C) en TS1. Nota: si los embriones son todavía hinchada, mantenerlos en TS1 de 1 hasta 3 min. </li><li> Recoger los embriones y transferirlos a la primera gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar un temporizador de 3 minutos </li><li> Después de 3 minutos, la transferencia de embriones para la segunda caída y luego a la tercera gota (Fig. 3E). </li><li> Transferir los embriones al medio de cultivo preparado en el Paso 3.1. Los embriones están en la forma que se muestra en la fig. 2D. </li><li> Introducir la cápsula en una incubadora de CO 2. A unos 10 minutos más tarde, la transferencia de embriones a la siguiente gota de medio de cultivo para lavar la sacarosa que se ha llevado a más de TS2. </li><li> Al cultivo en un incubador de CO2 hasta que la transferencia de embriones. Nota: Transferencia de Embryos a los oviductos de las hembras receptoras en el día de la descongelación. La cultura a largo in vitro puede disminuir la viabilidad de los embriones en algunas cepas de ratones. </li></ol> 4. Los resultados representativos: In vitro - in vivo y de desarrollo de los embriones después de la descongelación se presentan en las Tablas 1 y 2. Las ventajas de este protocolo son la alta supervivencia de los embriones después de la descongelación y su amplia aplicabilidad a diferentes cepas de ratones. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensión </td><td> N º total de tubos </td><td> N º de embriones vitrificados </td><td> Recuperados (N º (%)) </td><td> Morfológicamente normales (N º (%)) </td><td> El desarrollo de los blastocistos (N º (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. In vitro, el desarrollo de los embriones vitrificados-descongelados en las cepas de ratón común <table border="1"><tbody><tr><td> Condición de los embriones </td><td> N º de hembras receptoras </td><td> N º de embriones transferidos </td><td> Los lugares de implantación (N º (%)) </td><td> Viven descendientes (N º (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrificado </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabla 2. En vivo, el desarrollo de los embriones vitrificados-descongelados en ratones C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Figura 1. El esquema general del experimento, con el equilibrio, la vitrificación y descongelación de embriones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Figura 2. La morfología de los embriones en cada etapa de la descongelación. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Figura 3. Descongelación de los embriones de procedimiento. Todos los procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente. (A), Añadir 850 l de TS1 (37 ° C) en un criotubo y la transferencia de la totalidad del volumen de la solución en el criotubo en un plato de plástico. En este momento, los embriones vea hinchado, como se muestra en la fig. 2B. (B), se extendió la solución sobre la superficie del plato por agitación suave. (C), colocar tres gotas 50 l de TS2 en el plato de plástico. (D), de transferencia de los embriones a la primera gota de TS2. Después de 3 minutos, los embriones buscar shurunken como se muestra en la fig. 2C. (E), de transferencia de los de seriemente en el resto de TS2 gotas y luego al medio de cultivo.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Desde el primer informe de la vitrificación de embriones de ratón por Rall y Fahy en 1985 2, varias mejoras técnicas se han hecho para aumentar la capacidad de supervivencia de los embriones después de la descongelación. Una de las modificaciones de mayor éxito se logra mediante el uso de glicol de etileno como un crioprotector, debido a su baja toxicidad y alta permeabilidad de la membrana. Estas ventajas nos permiten manejar la congelación de embriones a temperatura ambiente 4; otros métodos de vitrificación de embriones requieren entregar a temperaturas más bajas y no siempre son aplicables a algunas cepas de ratones como BALB / c 6. Vitrificación de etileno primera base de glicol fue desarrollado por Kasai et al. en 1990 5,7. Debido a que el método original fue optimizado para pajillas de plástico como envases, hemos modificado ligeramente el protocolo para criotubos, que son de más fácil acceso en los laboratorios y más resistente a daños físicos. Por lo tanto, el método de vitrificación descritos aquí pueden ser de aplicaciónlicable de muchos laboratorios con ratones como modelos de investigación. El mismo método también se puede utilizar para los embriones de ratón en la mórula y blastocisto etapas 8 y 9 embriones de rata. Sin embargo, recientemente hemos encontrado que la calidad de criotubos puede afectar las tasas de supervivencia de los embriones después de la congelación-descongelación. Por lo tanto, es esencial para examinar la superficie interna de los criotubos por su suavidad antes de la vitrificación de embriones (por ejemplo, ver en la Mesa de reactivos y equipos específicos). Métodos de vitrificación tienen muchas ventajas sobre los métodos convencionales de congelación lenta, pero sí tienen una desventaja con respecto a la finalidad del transporte. Como embriones vitrificados deben mantenerse por debajo de -120 ° C para mantener su viabilidad, cargadores secos se utilizan generalmente para su transporte seguro. Embarcadores secos son pesados ​​y voluminosos, y su ida y vuelta es caro, especialmente para el transporte internacional. Ahora estamos desarrollando un método de vitrificación nuevoque los embriones vitrificados pueden almacenarse a temperatura de hielo seco (alrededor de -80 ° C) durante al menos 7 días 10. Este método debe ser la vitrificación de la próxima generación.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilenglicol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sUB&gt; S </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> De MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Criotubo </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogénico&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

La criopreservación de embriones de ratón es una base tecnológica que soporta las ciencias biomédicas, ya que muchas cepas de ratones han sido producidos por modificaciones genéticas y el número está aumentando constantemente año tras año. Su desarrollo técnico se inició con los métodos de congelación lenta en la década de 1970 1, seguido de los métodos de vitrificación desarrollada a finales de 1980 2. Por lo general, esta última técnica tiene la ventaja de su rapidez, sencillez y una alta supervivencia de los embriones recuperados. Sin embargo, el contenido crioprotectores son altamente tóxicos y pueden afectar al desarrollo posterior del embrión. Por lo tanto, la técnica no era aplicable a ciertas cepas de ratones, incluso cuando las soluciones se enfría a 4 ° C para mitigar los efectos tóxicos durante la manipulación de embriones. En el Centro RIKEN recursos biológicos, más de 5000 cepas de ratones con diferentes antecedentes genéticos y fenotipos se mantienen 3, y por lo tanto, hemos optimizado un te vitrificaciónchnique con la que podemos criopreservar los embriones de muchas cepas diferentes de ratones, con los beneficios de supervivencia de los embriones de alta después de la vitrificación y descongelación (o licuefacción, más precisamente) a la temperatura ambiente 4. Aquí se presenta un método de vitrificación de embriones de ratón que ha sido utilizado con éxito en nuestro centro. La solución de criopreservación contiene glicol de etileno en lugar de DMSO para minimizar la toxicidad para los embriones de 5. También contiene Ficoll y sacarosa para la prevención de desvitrificación y el ajuste osmótico, respectivamente. Los embriones pueden ser manejados a temperatura ambiente y se introducen en nitrógeno líquido a menos de 5 min. Debido a que el método original fue optimizado para pajillas de plástico como envases, hemos modificado ligeramente el protocolo para criotubos, que son de más fácil acceso en los laboratorios y más resistente a daños físicos. También se describe el procedimiento de descongelación de embriones vitrificados en detalle porque se trata de un ste críticap para la recuperación eficiente de los ratones vivos. Estas metodologías sería útil para los investigadores y técnicos que necesitan la preservación de cepas de ratón para su uso posterior de una manera segura y rentable.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Un etilenglicol basado en el método de vitrificación de embriones de ratón se describe. Es conveniente que otros métodos en su simplicidad y la toxicidad embrionaria bajo, y por lo tanto se puede aplicar ampliamente a muchas cepas de ratones, incluyendo ratones endogámicos y el gen modificado.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Investigación

Biología

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolección y criopreservación de ovocitos de hámster y de embriones de ratón

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Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

La criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transferencia de genes en embriones de pollo por los mayores<em&gt; Ex ovo</em&gt; La electroporación

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...