Financiación parcial del proyecto de investigación del USDA en varios estados W-2171 &quot;de células germinales y el desarrollo embrionario y la manipulación para la Mejora de la Ganadería&quot; se agradece. El talento artístico de Ryan Callahan, quien preparó las ilustraciones técnicas para la parte de vídeo de este artículo, también se agradece.

1. Evaluar la idoneidad de embriones para la Criopreservación de un <ol><li> Especímenes capturados en el tracto reproductivo de las hembras donantes individuales deben ser colocados en un medio isotónico embrión explotación durante 10 minutos antes de la evaluación mediante un microscopio estereoscópico. Esté seguro de mantener a los embriones de cada hembra donante separadas unas de otras para permitir la identificación de la paternidad de la descendencia de transferencia de embriones. </li><li> Utilizando magnificación baja (≤ 10 veces), las muestras de una hembra donante deben ser separados en grupos separados que consiste en óvulos no fertilizados, los embriones degenerados o embriones transferibles de calidad. Sólo el grado de calidad 1 o 2 embriones en la mórula compacta a través de etapas de desarrollo de blastocisto expandido son adecuados para la criopreservación, y todos los demás debe ser descartado (a menos que las mujeres sincrónica receptores están disponibles para la calidad de los embriones de grado 3 y una tasa de embarazo después de la transferencia de aproximadamente 25 30% se considera aceptable). </li><li> Inspeccione el grado de calidad 1 y 2 de mórula compacta mediante la ampliación de los embriones en estadio de blastocisto un aumento ≥ 50 veces para asegurarse de que la zona pelúcida del embrión está intacto y que no hay material (por ejemplo, las células, moco) que se adhiere a la zona pelúcida. Cualquier embrión con un roto o falta la zona pelúcida o con una zona pelúcida con material adherente debe estar separados de los otros embriones y, o bien ser desechados o procesados ​​por separado. </li></ol> 2. Los embriones de lavado para reducir la probabilidad de transmisión de la enfermedad 2 <ol><li> Mueva la zona pelúcida intacta embriones en un volumen mínimo de medio embrión isotónica explotación en el primer pocillo de medio de lavado de embriones (por ejemplo, solución salina de fosfato aumenta con antibióticos y suero bovino de albúmina sérica, ternero recién nacido, o alcohol de polivinilo). Mantener los embriones de cada hembra donante por separado, y no trate de lavar más de 10 embriones a la vez. Mueva los embriones en un volumen mínimo de medio en cada lavado sucesivos para alcanzar una serie de dilución ≥ 1:100, y estar seguro de utilizar estéril consejos sobre la manipulación de embriones que se cambian entre cada lavado sucesivos. </li><li> Mueva los embriones a través de 4 lavados más, como se indica en 2.1. </li><li> Si la transmisión de enfermedades virales es motivo de preocupación, lavado de embriones de dos veces en una solución de tripsina 0,25%, para un tiempo total de exposición combinada a la tripsina de no más de 90 segundos. </li><li> Después de los dos se lava la tripsina, lavado de embriones de 5 veces más en el medio de lavado de embriones como se describe en 2.1. </li><li> Después del lavado de embriones final, los embriones en lugar de embriones isotónica la celebración de mediano plazo. </li></ol> 3. Deshidratación embriones antes de la crioconservación 3 <ol><li> Los embriones deben ser transferidos en un volumen mínimo de medio isotónico la celebración de embrión en una solución hipertónica (1.4 a 1.5 Concentración molar) de un agente crioprotector (CPA), tales como etilenglicol o glicerol. </li><li> Permita que los embriones que se siente en medio de congelación (solución hipertónica CPA) hasta alcanzar el equilibrio osmótico. Debido a que el etilenglicol penetra las células embrionarias más rápidamente que el glicerol, tiempos de equilibrio son generalmente menos de embriones en etilenglicol (5 min) que en glicerol (10 min). Parte de este tiempo de equilibrio se puede lograr durante y después de los embriones se cargan en la paja (que se describe en el paso siguiente). </li></ol> 4. Los embriones de carga en una paja de 0,25 ml de plástico para la criopreservación <ol><li> Conecte el extremo tapón de algodón de una pajita de plástico de 0,25 ml (11,5 cm de longitud de trabajo) a un dispositivo de carga de embriones, y aspirar aproximadamente 1,3 cm de solución hipertónica CPA en una paja debidamente etiquetados. Una variedad de procedimientos de etiquetado existe, incluyendo el uso de etiquetas impresas adscribirse a un tapón de paja o de otra paja conectados con un adaptador de paja. </li><li> Retire la paja de la solución de APC, y el aspirado de aproximadamente 0,15 cm de aire para crear una pequeña burbuja de aire dentro de la paja. </li><li> Aspirar un único embrión en alrededor de 0,8 cm de solución hipertónica CPA en la paja. </li><li> Retire la paja de la solución de CPA y el aspirado de aproximadamente 0,15 cm de aire para crear una segunda burbuja de aire diminutos dentro de la paja (burbujas de aire sirven para aislar físicamente el embrión dentro de la paja). </li><li> Aspirar aproximadamente 9,1 cm de la solución de APC para llenar completamente la paja, con la certeza de atraer un volumen suficiente de solución de APC para humedecer el cloruro de polivinilo (PVC) en polvo que existe en el extremo del enchufe de algodón de la paja. La solución CPA causa el polvo de PVC con gel y sellar el extremo de la paja. </li><li> Sellar el otro extremo de la paja con el polvo de PVC, plástico tapones de paja, o un cierre por calor. </li></ol> 5. La colocación de los embriones en una máquina de congelación de embriones velocidad controlada <ol><li> Cualquiera de baño de metanol o congelación con nitrógeno líquido con máquinas de vapor puede ser programado para la crioconservación de embriones de preimplantación. </li><li> La carga de la paja que contiene la Embry<html> os en una máquina de congelación, cuya temperatura se ha enfriado desde la temperatura ambiente hasta los -6 º C. Pajas de carga final de algodón tapar (a no ser de plástico tapones paja o adaptadores de paja se están utilizando, en la que el algodón caso extremo del enchufe se coloca hacia abajo). </li><li> Permita que los embriones que se siente a esta temperatura durante al menos 2 minutos antes de proceder. </li></ol> 6. Siembra <ol><li> Una vez que los embriones se hayan enfriado a -6 ° C, utilice un par de pinzas de súper en nitrógeno líquido (o un palo con punta de algodón sumergida en nitrógeno líquido) para inducir la formación de cristales de hielo en la solución de CPA dentro de la paja al tocar las pinzas (o algodón palo con punta) en la columna de la solución por encima o por debajo del embrión. </li><li> El agua en la solución de APC se cristaliza en la región expuestos a nitrógeno líquido, y cristales de hielo se extienda a la columna de la solución de APC de inmediato que rodea al embrión. </li><li> Mantener los embriones en la siembra de temperatura durante 10 minutos antes de enfriamiento. </li></ol> 7. La deshidratación continua de embriones <ol><li> Embriones frescos a una tasa de 0,5 ° C / min hasta una temperatura de -34 ° C. Esta velocidad de enfriamiento es importante asegurarse de deshidratación continua del embrión. </li><li> Mantener embriones a -34 ° C durante 10 minutos, antes de caer a los embriones en nitrógeno líquido (-196 ° C). </li><li> Lugar criopreservado embriones en una copa debidamente etiquetados (lleno de nitrógeno líquido) unido a una caña debidamente etiquetados, y colocar el bastón en un recipiente de un termo de nitrógeno líquido para su almacenamiento a corto o largo plazo. </li></ol> 8. Descongelar embriones criopreservados <ol><li> Tire de la lata en el cuello del termo de nitrógeno líquido, asegurando que el recipiente se mantiene por debajo de la línea de hielo en el termo. </li><li> Localice la caña que contiene el embrión para ser descongelados, y rápidamente y retire con cuidado la paja de la copa, tener la certeza de que no se caliente otras pajas en la copa. </li><li> Sujete la paja en el aire durante 3-5 segundos (para reducir la incidencia de un agrietado zona pelúcida 4), ​​y luego se sumergen en un baño de agua 37 ° C por un período adicional 25-30 segundos. </li><li> Quitar la paja del baño de agua, limpie la paja (con cuidado de no ensuciar la identificación de embriones en la paja), utilizar un dispositivo de corte de la paja para cortar el extremo del enchufe no sean de algodón de la paja (si es sellado con calor o con polvo de PVC ), o retirar con cuidado el tapón de cierre de plástico, y ya sea: <ol type="a"><li> carga de la paja en un dispositivo de transferencia de embriones y la transferencia lo antes posible a un destinatario embrión sincrónica (pero sólo si el embrión fue criopreservado con etilenglicol como la CPA), o </li><li> Mantenga la parte de la paja sobre un plato que contiene una concentración de 1,0 molar de sacarosa (un compuesto no penetra), y el uso de un par de tijeras para cortar el extremo del enchufe de algodón de la paja. Contenido de la paja debe fluir libremente en la solución de sacarosa, sino a impulsar una pequeña columna de aire a través de la paja puede ser necesaria si ningún medio residual existe dentro de la paja. Permita que los embriones a permanecer en una solución de sacarosa durante 10 minutos, y luego se transfieren los embriones a embriones isotónica la celebración de medio durante 10 minutos. Evaluar embriones post-descongelación, la carga de paja en una nueva, y la transferencia a hembras receptoras adecuadas. </li></ol></li></ol> 9. Los resultados representativos: Una variedad de factores pueden influir en el embarazo y tasas de nacidos vivos como resultado de la transferencia de embriones de preimplantación congelados a hembras receptoras sincrónica 5. Los embriones en etapas de desarrollo menos avanzado que el de mórula compacta o avanzado más de blastocisto expandido a menudo no sobreviven el proceso de criopreservación de embriones, así como en la mórula compacta y blastocisto temprano, blastocisto, y amplió las etapas del desarrollo embrionario de blastocisto. Embriones de calidad de grado 1 y 2 de mayor rendimiento deshielo post-las tasas de embarazo que la calidad de los embriones de grado 3 (que por lo general no son criopreservados, debido a la baja las tasas de embarazo después de la descongelación). Embriones mal manejo durante la congelación de embriones o el embrión descongelado procedimientos son propensos a exhibir tasas de reducción de embarazo. Embriones transferidos a hembras receptoras cuyos ciclos del estro no se han sincronizado con el de la hembra donante normalmente producen menores tasas de embarazos. Embriones producidos in vitro o manipulados de alguna forma (por ejemplo, una biopsia o dividida en dos) por lo general menor rendimiento tasas de embarazo. Bajo condiciones óptimas, las tasas de embarazo obtenidas luego de la transferencia de los congelados los embriones es típicamente un 60-70% en el ganado 6,7, 65-75% en el ganado ovino 8,9,10,11 y 60 a 70% en el ganado caprino 12,13,14,15. Del mismo modo, las tasas de embarazo obtenidas luego de la transferencia de los congelados embriones producidos in vitro suele ser un 40-50% en el ganado 6,16, 25-35% en el ganado ovino 17, y 30-40% en las cabras de 18 años. tabla 1 &quot;/&gt; Tabla 1. Esperado las tasas de embarazo después de la transferencia de embriones congelados de animales domésticos de las especies de rumiantes ganado a hembras receptoras sincrónica.

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S., Cogni&#233;, Y., Mermillod, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vitrification+method+allowing+direct+transfer+of+goat+embryos.">Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos.</a> Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).</li><li>Nowshari, M. 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No hay conflictos de interés declarado.

Porque los embriones son, sobre todo de agua, es fundamental que los embriones de preimplantación adecuadamente deshidratado y se enfrió lentamente, de acuerdo con el protocolo descrito en este documento para evitar la formación de cristales de hielo intracelular. Una vez que el proceso de enfriamiento ha comenzado, es importante para mantener los cambios de temperatura y unidireccional para evitar las fluctuaciones de temperatura. Inicio de la formación de cristales de hielo (&quot;siembra&quot;) a una temperatura adecuada para la solución específica del CPA es fundamental. Las modificaciones a este enfriamiento lento / método rápido deshielo de la criopreservación de embriones de preimplantación incluyen el método de un solo paso (en la última columna del medio de carga en la paja es la sacarosa en lugar de solución CPA) 19 y el método de transferencia directa (cuando los embriones congelados en etilenglicol se descongelan y se transfieren directamente al útero de una hembra receptora sin quitar primero el glicol de etileno a partir del embrión) 20. Para reducir el volumen de etilenglicol depositado en el útero de una transferencia directa (DT) mujeres destinatario, es recomendable llenar la paja de 0,25 ml con 6 cm de la celebración de medio antes de continuar como se describió anteriormente. Cabe señalar que existe una norma voluntaria dentro de la industria de transferencia de embriones comercial que preimplantación de embriones criopreservados para su DT deben ser congelados de color amarillo paja y se almacena en copas de color amarillo en el termo de nitrógeno líquido. El sector comercial también tiene requisitos específicos de etiquetado para todos los embriones congelados que se deben seguir. Una alternativa a este método es la vitrificación de 21 años, el método de no equilibrio de criopreservación, donde se enfría una mayor concentración (6.8 M) CPA solución ultra-rápidamente causando la solución APC para cambiar de estado líquido a una &quot;vidriosa&quot; estado sin hielo la formación de cristales. La vitrificación es probablemente más adecuado para la crioconservación de embriones que son menos avanzados que el desarrollo de mórula compacta debido a su sensibilidad a la temperatura aumenta. Esta técnica tiene una aplicación para la conservación de los recursos de germoplasma 22, así como a los internacionales de la industria comercial de la transferencia de embriones, donde más del 55% de los aproximadamente 500.000 preimplantación de embriones de bovino transferidos en el año calendario 2008 fueron criopreservados. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> BioLife medio de congelamiento </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C18A C18, </td><td> 1,5 M etilenglicol </td></tr><tr><td> Emcare etilenglicol congelación de la solución </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1,5 M etilenglicol </td></tr><tr><td> Etileno glicol Vigro freeze plus </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM835 </td><td> 1,5 M etilenglicol </td></tr><tr><td> Emcare 10% de glicerol solución de congelación </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC12 </td><td> 1,34 M de glicerol </td></tr><tr><td> Emcare 1 M sacarosa deshielo </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC16 </td><td> 1,0 M sacarosa </td></tr><tr><td> Vigro un paso deshielo </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1,0 M sacarosa </td></tr><tr><td> Vigro deshielo 1-2-3 más </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2,5%, 0% de glicerol con 0,5, 0,5, 0,6% de sacarosa </td></tr><tr><td> Emcare CSU descongelación kit </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% de glicerol con un 10,3% de sacarosa </td></tr><tr><td> BioLife tenencia y medio de transferencia </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C15, C15A </td><td> modificado PBS con 0,4% de BSA (albúmina de suero bovino) </td></tr><tr><td> Emcare la celebración de una solución </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0,4% de BSA (albúmina de suero bovino), MOPS buffer (zwitteriones inerte) </td></tr><tr><td> Vigro la celebración de más </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> Sosteniendo SYNGRO medio </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> contiene ácido hialurónico, sin productos de origen animal </td></tr><tr><td> BioLife modificado D-PBS </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C06 </td><td> fosfato de Dulbecco modificado solución salina tamponada </td></tr><tr><td> BioLife BSA fracción V </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B09 </td><td> albúmina de suero bovino liofilizado, fracción V </td></tr><tr><td> BioLife antibiótico-antimicótico </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B01 </td><td> anfotericina B, penicilina G, sulfato de estreptomicina </td></tr><tr><td> BioLife tripsina kit </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C22A </td><td> 25 g de tripsina liofilizada, agua estéril, estéril D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Biol-Cool congelador velocidad controlada </td><td> FTS Sistemas </td><td> BC-IV -40 </td><td> Metanol congelador baño </td></tr><tr><td> Congelar el congelador de control velocidad controlada </td><td> Criológico </td><td> CL2200 </td><td> Congelador de nitrógeno líquido </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

Preimplantación de embriones de ganado vacuno, ovejas y cabras pueden ser criopreservados para su almacenamiento a corto o largo plazo. Preimplantación de embriones consisten principalmente en agua, y evitar la formación intracelular de cristales de hielo durante el proceso de criopreservación es de suma importancia para mantener la viabilidad del embrión. Los embriones son colocados en una solución hipertónica (1,4 a 1,5 M) de un agente crioprotector (CPA) como el etilenglicol (EG) o glicerol (GLI) para crear un gradiente osmótico que facilita la deshidratación celular. Después de embriones alcanzar el equilibrio osmótico en la solución de APC, son individualmente cargado en la solución hipertónica CPA en pajuelas de 0,25 ml de plástico para congelar. Los embriones son colocados en un congelador velocidad controlada a una temperatura de -6 ° C. La formación de cristales de hielo se induce en la solución de CPA que rodea el embrión, y la cristalización provoca un aumento en la concentración de la CPA fuera del embrión, provocando una mayor deshidratación celular. Los embriones se enfría a una velocidad de 0,5 ° C / min, lo que permite una mayor deshidratación, a una temperatura de -34 ° C antes de ser sumergido en nitrógeno líquido (-196 ° C). Embriones congelados deben descongelarse antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Pajillas que contienen los embriones se retiran de la termo de nitrógeno líquido, que se celebró en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 segundos, y se coloca en un baño de agua 37 ° C durante 25 a 30 segundos. Embriones criopreservados en GLI se colocan en una solución 1 M de sacarosa durante 10 minutos para la eliminación de la CPA antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Embriones congelados en EG, sin embargo, pueden ser directamente transferidos al útero de un destinatario.

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Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantación de embriones criopreservados pueden ser después de la colocación en una solución hipertónica de crioprotectores a causa deshidratación celular. Después de equilibrio, la formación de cristales de hielo se induce en la solución que rodea al embrión. Una mayor deshidratación se produce cuando el embrión se enfría lentamente a temperaturas bajo cero antes de sumergirse en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

La criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

cryopreservation-of-preimplantation-embryos-of-cattle-sheep-and-goats

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K vistas.  Iowa State University. Preimplantación de embriones criopreservados pueden ser después de la colocación en una solución hipertónica de crioprotectores a causa deshidratación celular. Después de equilibrio, la formación de cristales de hielo se induce en la solución que rodea al embrión. Una mayor deshidratación se produce cuando el embrión se enfría lentamente a temperaturas bajo cero antes de sumergirse en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Video: Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Investigación

Biología

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolección y criopreservación de ovocitos de hámster y de embriones de ratón

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...