Gli autori desiderano ringraziare Alexei Bogdanov per la realizzazione di patch-clamp chip al CPFC e Hue Tran, Zhao Ping e Matthew Shiu per l&#39;assistenza al montaggio. Naweed Syed è stata sostenuta da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzione. Collin Luk è il destinatario di NSERC e Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) borse di studio.

1. Chip fabbricazione Il processo descritto in 6 risultati in uno spessore di 3 um autoportante pellicola, una bassa resistenza di accesso 1 Mohm e una superficie liscia imbuto un&#39;apertura a forma che facilita una tenuta intimo con la cella 9, vedi figura 2. I chip vengono singulated e incollati in pacchetti di plexiglas con l&#39;apertura rivolta verso un foro di collegamento del chip di un canale sotterraneo. L&#39;incollaggio viene erogato in modo da minimizzare la capacità di uno shunt nominale 17 pF. I pacchetti sono dotati di due 1,5 mm di diametro e 6 mm, tubi di vetro lunghe, come le porte fluidici (Figura 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopio elettronico a scansione di una sezione mirata fascio di ioni di un NRCC patch-clamp circuito mostra una superficie liscia e biossido di silicio a forma di imbuto che favorisce i contatti intimi cellulari, e un orifizio superficiale che rappresenta una resistanc accesso a bassoe. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figura 3. Un chip viene incollato sul fondo del flacone di coltura in un pacchetto plexiglas dotato fluidica sotterranee e tubi di vetro. 2. Sterilizzazione, adescamento e test Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una cella di sicurezza per evitare la contaminazione di biologia o di collegare dell&#39;apertura. <ul type="disc"><li> Sterilizzare chip in un pulitore Harrick base plasma (www.harrickplasma.com) con una pressione dell&#39;aria 0,1-0,3 mbar residua per 15 minuti alla potenza massima di 18 W. Altri sistemi di aerei plasma può essere utilizzato, con densità di potenza paragonabile (24 mW / cm 3) e mantenendo il prodotto della densità di potenza e costante di tempo. Il trattamento al plasma rende anche i chip idrofilo, che facilita adescamento. </li><li> Montare tubi di vetro sterile, con tubi in silicone Silastic Laboratory, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96.115-08), 3inch su un lato, 1 pollice sull&#39;altro lato. </li><li> Riempire fluidica attraverso i tubi sterili con tampone fosfato filtrato standard (PBS), assicurandosi che nessuna bolla è intrappolato. </li><li> Agganciare il tubo lungo in silicone, mentre la pressurizzazione della PBS dal lato corto a 1 atm. Un pool di PBS filtra attraverso l&#39;apertura potrebbe essere visibile nel flacone. Agganciare il pressurizzata della PBS e staccare il tubo corto in silicone da quello di alimentazione. </li><li> Riempire flaconcino con filtrata PBS utilizzando una siringa. </li><li> Immergere uno Ag / Ag: elettrodo di Cl nel tubo corto e un contro-elettrodo nel flacone. Un misuratore di impedenza viene usato per confermare che la resistenza di accesso è tra 300kohm e 3mohm e la capacità shunt è tra 10pF e 25pF. Un chip con una minore resistenza può avere una perdita, e una capacità superiore è da considerarsi improprio per l&#39;uso in quanto non può catturare più rapida dinamica di elettrofisiologia della cella 6. Un chip con una capacità inferioreo maggiore resistenza è considerato collegato, anche se potrebbe essere semplicemente una bolla che è intrappolato nel orifizio. Alcuni chip sono ri-testati dopo 1H e dimostrato di avere la corretta impedenza elettrochimica. </li><li> Lavare il canale fluidico con acqua deionizzata sterile; svuotare il flacone superiore e sciacquarlo con la stessa, due volte. </li><li> Immergere il chip confezionato con tubi in acqua fresca sterile deionizzata per 30 minuti quindi caricare con altri chip in un contenitore sterile riempita con acqua deionizzata sterile. Questo assicura che i chip rimangono idrofilo e protetto dalla contaminazione. </li></ul> 3. Chips di preparazione in laboratorio di biologia cellulare Le seguenti operazioni vengono eseguite in una cappa HEPA filtrato flusso laminare utilizzando tecniche asettiche, tutte le soluzioni utilizzate in questa procedura deve essere filtrata sterilizzati prima dell&#39;uso utilizzando un filtro 0.22μm. <ul type="disc"><li> Aprire un contenitore chip sotto una cappa HEPA filtrato flusso laminare e rimuovere i chip da Container a faccia in giù per evitare di scavare possibili contaminanti galleggianti nella fiala top. </li><li> Risciacquare superiore della fiala di 2x chip con appena filtrata acqua sterile deionizzata per rimuovere eventuali detriti residuo dalla superficie del chip. </li><li> Aspirare acqua deionizzata sterile dalla fiala in alto. </li><li> Collegare un&#39;estremità della tubazione di silastic collegato al canale fluidico di una siringa pressurizzato contenente acqua filtrata sterile deionizzata. Nel nostro sistema, siringhe piene di soluzione sono sotto pressione da il collegamento ad un serbatoio di aria compressa impostato a 20psi. Per assicurare la sterilità, l&#39;aria viene filtrata (0,22 um filtro) prima dell&#39;ingresso nella siringa e il sistema ha anche una valvola on / off che ci permette di interrompere o applicare pressione quando necessario. </li><li> Utilizzando un emostatico, bloccare l&#39;estremità di uscita del tubo. </li><li> Aprire il valvole on / off per pressurizzare la soluzione. </li><li> Per risciacquare il fluidico subterranen del chip con acqua fresca sterile deionizzata, sbloccare l&#39;estremità di uscita del tubo. </li><li> Per dice l&#39;acqua attraverso l&#39;apertura, bloccare l&#39;estremità di uscita del tubo con una pinza emostatica. </li><li> Per evitare il drenaggio dell&#39;acqua, bloccare le estremità di ingresso e di uscita del tubo con un hemostats e chiudere il valvole on / off. </li><li> Rimuovere l&#39;estremità di ingresso del tubo dalla siringa. </li><li> Inserire i tasselli di vetro in entrambe le estremità del tubo e rimuovere i hemostats. </li><li> Riempire top flaconcino con acqua deionizzata steriled filtro. </li><li> Posizionare il coperchio di un piatto 35 millimetri sterile nella base di un piatto 100 millimetri sterile </li><li> Chip di posizione sulla sommità del coperchio 35 mm e con coperchio 100 millimetri coperchio piatto. </li><li> Chip immagine per assicurare che la membrana e l&#39;apertura dei chip sono liberi di detriti e / o bolle d&#39;aria. Nel nostro laboratorio utilizzare un microscopio montante ed un obiettivo 20x lunga distanza di lavoro. </li><li> Se detriti e / o bolle d&#39;aria sono presenti, lavare ripetutamente il canale fluidico e il flaconcino top. Se i detriti e / o bolle d&#39;aria non può essere rimosso il chip viene scartato. </li><li> Una volta che i chip sonoimmaginata, tornare alla cappa a flusso laminare e staccare entrambe le estremità del tubo. </li><li> Collegare un&#39;estremità del tubo ad una siringa contenente pressione dei media fisiologici. </li><li> Fissare la estremità di uscita del tubo con una pinza emostatica </li><li> Aprire la valvola di pressione, rimuovere la pinza emostatica dalla fine uscita dei fluidica e lavare il canale fluidico con i media fisiologici </li><li> Per risciacquare fluidico sotterraneo con mezzi fisiologici, aprire la valvole on / off e rimuovere la pinza emostatica dalla fine del tubo di uscita. </li><li> Per imporre il supporto fisiologiche attraverso l&#39;apertura, bloccare l&#39;estremità di uscita del tubo con una pinza emostatica. </li><li> Morsetto terminale di ingresso del tubo con una pinza emostatica e chiudere il valvole on / off. </li><li> Rimuovere l&#39;estremità di ingresso del tubo dalla siringa e spina entrambe le estremità del tubo con tappi glas. </li><li> Rimuovere le hemostats. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua dalla fiala superiore. </li><li> Riempire il flacone in alto con filtro dei media sterilizzati fisiologici. </li><li>Posizionare il nuovo chip nel piatto mm 100 Petri. </li><li> Posizionare la base di un piatto 35 millimetri nella capsula 100 mm e riempirlo con filtro ad acqua sterilizzata deionizzata per arricchire umidità. </li><li> Coprire il piatto fino a quando non è tempo per la placcatura </li></ul> 4. Placcatura cellulare di neuroni di lumaca Le patch-clamp chip può essere adatto per una varietà di preparazioni. Al momento stiamo testando le nostre chips con mammiferi neuroni corticali primarie e hanno ottenuto risultati preliminari con cellule in coltura per 14 giorni 7, il che indica che il nostro protocollo di sterilizzazione è adeguata e che i chip non sono citotossici in colture a lungo termine. Ai fini del presente protocollo, i neuroni di lumaca sono stati scelti perché rappresentano un modello semplice ma ben consolidata per studiare neuronale elettrofisiologia 11, ed è con quelle cellule che abbiamo ottenuto i risultati più significativi fino ad oggi 10. Isolamento delle cellule dettagliata e le procedure di coltura hannostato descritto in precedenza 12, 13. <ul type="disc"><li> Togliere il guscio esterno 2-3 stagnalis vecchia mesi Lymnaea con pinza smussati e anestetizzare gli animali in Lymnaea saline contenenti il 10% Listerine. Tutte le fasi successive effettuate in modo asettico in una cappa a flusso laminare attrezzature dissezione sterilizzata e soluzioni a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire i media fisiologiche nelle fluidica con la soluzione di registrazione appropriata usando una pipetta Eppendorf. Nel caso di neuroni Lymnaea la soluzione contiene (in mM): 50 KCl, 5 MgCl 2, 5 etilenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetico (EGTA) e 5 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) 14 </li><li> Pin le lumache in un piatto pieno di Sylgard Lymnaea soluzione salina e rimuovere intero cervello come descritto in precedenza 13 </li><li> Trattare il isolatEd il cervello in mezzi definiti (DM) con tripsina dell&#39;enzima (0,2% Solution, Sigma, Catalog # T-9201) per 18 minuti, seguita da trattamento in DM e inibitore della tripsina (Sigma, soia, Catalog # T-9003) per 15 minuti. </li><li> Appunta il cervello in un piatto Sylgard piccola riempita con osmolarità elevata definita media (HODM - DM con glucosio aggiunto, 750 ml di soluzione di glucosio 1 M a 20 mL DM). </li><li> Utilizzo di pinze e forbici dissezione fine, rimuovere la guaina esterna e interna dei gangli di interesse, esponendo i neuroni. </li><li> Usando una pipetta di vetro lucidato fuoco riempito HODM e attaccato ad una microsiringa, applicare aspirazione delicata prossimità della cella di interesse (sinistra dorsale del piede 1) fino a quando il neurone stacca dal cervello e viene sospeso nella pipetta. </li><li> La pipetta di vetro viene quindi spostata e immersi in neurochips singoli dove espulsione dolce dal microsiringa permette i neuroni da delicatamente spinto fuori della pipetta e posto sulla sommità dei fori patch sui singoli chip.</li><li> Permettere alle cellule di riposare per un minimo di 2 ore a temperatura ambiente per promuovere la loro adesione alla superficie del chip che circonda l&#39;apertura. </li></ul> 5. Le registrazioni elettrofisiologiche Per collegare i chip per l&#39;amplificatore (nel nostro caso un amplificatore Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Sostituire la soluzione nel fluidica sotterraneo e nel flacone chip con le soluzioni di registrazione appropriate. Nel caso di neuroni Lymnaea, le camere di coltura superiori sono riempiti con Lymnaea salina (in mM: 51,3 NaCl, KCl 1,7, 4 CaCl2 e MgCl2 1,5) tamponata a pH 7,9 con HEPES 14. </li><li> Per la stabilità, la colla il chip su un vetrino e metterla sotto un microscopio. </li><li> Per collegare il chip per l&#39;amplificatore (nel nostro caso un amplificatore Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), tagliare un&#39;estremità del tubo e inserire un Silver filo che è collegato alla testa-stadio. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di riferimento nel flacone superiore del chip. </li><li> Il chip è ora pronto per la registrazione. </li><li> Applicare un passo 5 mV con l&#39;amplificatore per misurare la resistenza totale (R t) e determinare la configurazione dei neuroni: cell-attached (R t&gt; 1 GΩ); cellula intera (Rt = 50-100 transienti mQ più capacitivo, indicativo di rottura della membrana sull&#39;apertura), oppure no tenuta (R t &lt;5 mQ). Nella nostra ultima serie di 10 esperimenti, il 58% per cento delle cellule avevano guarnizioni ad alta resistenza e, di questi, l&#39;80% delle cellule ha mostrato risposte eccitabili. </li></ul> 6. Risultati rappresentativi <ul type="disc"><li> Applicare depolarizzante impulsi di corrente (20 incremento pA) al neurone (in questo caso LPeD1). </li><li> Tenere il neurone alla chiusura Vm al suo potenziale di riposo (~ - 60 mV). </li><li> Osservare le risposte a questi impulsi depolarizzanti. Superamento potenziali d&#39;azione dovrebbeessere osservata se il neurone è vitale. </li><li> Figura 4 mostra un risultato rappresentativo che è discussa in dettaglio in 14, 15. </li></ul><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Figura 4 risposte tensione. (In alto) di un neurone LPeD1 alla serie graduata di intracellulari impulsi di corrente (sotto). Gli impulsi di corrente sono stati applicati a Vm = - 60mV. Risoluzione dei problemi <ul type="disc"><li> Prima di placcatura, trucioli di immagine per determinare se membrana e apertura sono liberi di detriti e adatto per la placcatura. Noi usiamo un microscopio verticale e uno 20x obiettivo a lungo distanza di lavoro. Nella nostra ultima serie di esperimenti 1, 67% dei chip sono stati correttamente innescato in quel modo. </li><li> Se detriti e / o bolle d&#39;aria sono presenti scartare chip e provare un altro. </li><li> Diversi trattamenti superficiali (plasma) o rivestimenti (PDL, PEI ecc) può essere provato, ma il successo può essere fortemente dipendente dal tipo di cellulautilizzato. </li><li> La composizione del (&quot;pipetta&quot;) in soluzione fluida critico per la formazione del giga-sigillo e la cellula intera. Regolare la soluzione, facendo attenzione a osmolarità, pH, e il trucco ionica. </li><li> Per la cultura a lungo termine, iniziano con i media nel canale microfluidica, quindi passare alla pipettare soluzione prima della registrazione mediante perfusione dolce alimentato a gravità (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

NRCC di patch-clamp piattaforma interrogatorio chip è uno strumento potenzialmente efficace per le prove ad alto contenuto di informazione farmaceutica e di indagare in modelli in vitro di malattia. I suoi vantaggi rispetto alle pipette di vetro sono una resistenza di accesso bassa, che è un vantaggio per sondare le cellule grandi, e nonostante una capacità leggermente maggiore comporta dinamica comparabili per celle più piccole. Cellula spontanea alle guarnizioni di apertura sono stati regolarmente ottenuti, e l&#39;entrata a cellula intera è stato osservato che il 14 spontanea. Una chiara differenza tra i chip e il metodo pipetta di vetro è il fatto che la sonda è parte della piastra di coltura cellulare e non è manualmente portato in contatto con la membrana cellulare. Coltura di cellule, eventualmente parte di reti funzionali, risultati in modelli più biologicamente rilevanti, come modelli di malattia, e un diverso meccanismo per assicurare celle ad alta tenuta per sondare 16. Tuttavia, in contrasto con sospensioni cellulari, aspirazione cannot essere utilizzato per posizionare una cella sulla sonda. Neuroni Snail, come altre grandi cellule, sono suscettibili di posizionamento manuale sulla parte superiore della sonda. Per il posizionamento piccole cellule che richiedono lunghi tempi di coltura, si è ovviato la necessità di manipolazione e di mantenere una elevata probabilità di ottenere un sigillo di polipeptidi adesione patterning sopra le sonde per posizionare le cellule sopra delle sonde, e ha dimostrato di celle sul Sonda 17,18. NRCC sta sviluppando una poliimmide microfluidica patch-clamp circuito 19 con una capacità paragonabile a quella del vetro pipetta. L&#39;obiettivo finale di tale progetto è a più sonde patch-clamp chip che consente il monitoraggio simultaneo dell&#39;attività elettrofisiologica dei neuroni più impegnate nel comportamento della rete alla risoluzione dei canali ionici singoli 14. Questo metodo è un metodo ad alta risoluzione complementare a multi-elettrodo array 20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

Grazie alla sua squisita sensibilità e la capacità di monitorare e controllare le singole cellule a livello dei canali ionici, patch-bloccaggio è il gold standard di elettrofisiologia applicata a modelli di malattia e gli schermi farmaceutiche egualmente 1. Il metodo comporta tradizionalmente delicatamente a contatto una cellula con una pipetta di vetro riempita da una soluzione fisiologica per isolare una zona della membrana sotto il suo apice 2. Un elettrodo inserito nella pipetta cattura canale ionico attività all&#39;interno del cerotto membrana o, quando rottura, per tutta la cella. Nell&#39;ultimo decennio, patch-clamp chip sono stati proposti come alternativa 3, 4: una pellicola sospesa separa il mezzo fisiologica dal mezzo di coltura, e un&#39;apertura microfabbricata nel film sostituisce l&#39;apice della pipetta. Patch-clamp chip sono stati integrati in sistemi automatizzati e commercializzato per la high-throughput screening 5. Per incrfacilità velocità, esse comprendono la fornitura fluidico di celle da sospensione, il loro posizionamento sul diaframma di aspirazione, e procedure automatizzate per rilevare cellula-sonda guarnizioni ed entrare nella modalità a cellula intera. Abbiamo riportato la realizzazione di una patch-clamp chip di silicio con impedenza ottimizzati e la forma dell&#39;orifizio che permette l&#39;alta qualità di registrazione dei potenziali d&#39;azione nei neuroni di lumaca colture 6; di recente, abbiamo segnalato i progressi compiuti interrogando i neuroni dei mammiferi 7. I nostri patch-clamp chip sono realizzati presso la Canadian Photonics Fabrication Centro 8, una fonderia commerciale, e sono disponibili in grande serie. Siamo desiderosi di impegnarsi in collaborazioni con elettrofisiologi per convalidare l&#39;uso della tecnologia NRCC in diversi modelli. I chip vengono usati secondo lo schema generale rappresentato nella figura 1: il chip di silicio è sul fondo di una fiala cultura plexiglas e la parte posteriore del diaframma è collegato ad un sotterraneo Channel dotato di tubi alle estremità del pacchetto. Le cellule vengono coltivate nella fiala e la cella sulla parte superiore della sonda è controllata da un elettrodo di misura inserito nel channel.The due porte fuori fluidici facilitare lo scambio di soluzione con il minimo disturbo alla cella, questo è un vantaggio rispetto alle pipette vetro per intracellulare perfusione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Figura 1. Principio di misurazione utilizzando la NRCC patch-clamp truciolo Noi dettaglio qui i protocolli di sterilizzare e innescare i circuiti integrati, caricarli con il mezzo, li piatto con le cellule, e, infine, li usano per le registrazioni elettrofisiologiche.

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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Mostriamo come planare patch-clamp chip fabbricato presso il National Research Council of Canada sono sterilizzati, innescato, caricato con il mezzo, placcato con le cellule, ed utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche.

Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.6K Views.  National Research Council of Canada. Mostriamo come planare patch-clamp chip fabbricato presso il National Research Council of Canada sono sterilizzati, innescato, caricato con il mezzo, placcato con le cellule, ed utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche.

Video: Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

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Neuroscienze

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.