Este estudio fue apoyado en parte por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), el proyecto de GZ PI 771/1-1, SFB 656 &quot;Imagen Molecular Cardiovascular&quot;, Münster, Alemania (proyectos C6, Z2, B3, y PM3), la Unión Europea Red de Excelencia &quot;de diagnóstico Imagen Molecular-DIMI &quot;(WP 11.1 y 11.2). El estudio fue financiado en parte también por la Fundación Británica del Corazón, el Reino Unido.

1. La preparación del modificador de esfuerzo cortante (puño) <ol><li> El modificador de esfuerzo cortante consta de dos mitades longitudinales de un cilindro con una luz en forma de cono. Las conchas están hechas de media polyetherketone termoplásticas producidas por un procedimiento de fundición de plástico. Los elementos de fundición se envían al mismo tiempo conectado al corredor. Por lo tanto, las conchas de la mitad tienen que ser cortada antes de su uso. Cada elenco contiene conchas medio de diferentes tamaños que van desde 150 m - 300 m (menor diámetro interior en el extremo de aguas abajo). </li><li> La preparación del manguito debe realizarse bajo un microscopio quirúrgico. </li><li> Mantenga la concha del manguito con una pinza roma y suavemente separado del molde mediante el uso de un escalpelo afilado. Este procedimiento dará lugar a la mitad de los precursores de la cáscara que tienen que ser procesados. </li><li> Coloque el precursor de media concha en una placa aun no resbalosa, fijarla con unas pinzas romas y cortar con exactitud a lo largo de la incisión preformados con el fin de remove el extremo cerrado. Esto dará lugar a la capa media del manguito listo para su uso. </li><li> Control de las conchas medio bajo el microscopio y retire con cuidado los bordes afilados restantes. La luz interior cónica es esencial para la inducción de diferentes calidades de esfuerzo cortante en el interior, aguas arriba y aguas abajo del manguito implantado. Una ranura en la superficie exterior de las conchas media perpendicular a la luz interior sirve como guía para el hilo que finalmente se pega las conchas medio para formar la banda funcional. </li><li> Almacenar los proyectiles medio puño, clasificadas según su tamaño, en el 70% de etanol. </li></ol> 2. La implantación de la banda alrededor de la arteria carótida derecha <ol><li> Ratones ApoE nocaut debe estar alrededor de 10 semanas de edad y un peso de al menos 20 gramos. Si el desarrollo de la placa debe ser investigada bajo dieta alta en colesterol, a partir de una dieta de tipo occidental 4 semanas antes de la implantación del manguito es recomendada. </li><li> El procedimiento quirúrgico completo debese realice en al menos semi-estériles condiciones: Llevar una bata quirúrgica mascarilla y gorro y guantes estériles. Esterilizar los instrumentos durante 30 segundos en un esterilizador de instrumentos de bolas y colocarlas en una lámina opaca estéril. ¡Cuidado! Instrumentos que se enfríe antes de usar! </li><li> Coloque el ratón en una cámara llena de inducción de la anestesia con isoflurano con un 3% hasta que esté completamente anestesiado. Comprobar la profundidad de la anestesia con la respuesta a una pizca dedo del pie. Por otra parte, la anestesia puede ser realizada con intraperitoneal (ip) inyección de ketamina (80 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) o anestésicos alternativo aprobado por el IACUC. Para la inyección ip, mantenga pulsado el ratón en posición supina y se inyecta el anestésico en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen. </li><li> Sitúa el ratón sobre una placa quirúrgica climatizada, en posición supina. Con el fin de evitar que los ojos de falta de agua los humedezca con colirio (por ejemplo, Bepanthen loción para los ojos y la nariz). Corre la delantera y traseras-las patas y la cinta hacia abajo a la placa. Si se realiza la anestesia con isoflurano, el flujo de gas narcótico (2% isoflurano) tiene que ser proporcionada a través de una máscara de roedores pequeños. </li><li> Eliminar el vello entre la mandíbula y el esternón por la aplicación de cualquiera de los agentes depilatorios (por ejemplo, Pilca Med) o mediante el uso de una multa máquina de afeitar eléctrica (por ejemplo, Wella Contura). De afeitar se debe realizar con precaución para evitar irritar la piel. Si se utiliza un agente depilatorio, darle 1-2 minutos para penetrar en el pelo, a partir de entonces, frote suavemente hasta que todo el pelo y el agente depilatorio es eliminado. </li><li> Han preparado previamente preparado mitades del manguito de diferentes tamaños (dos de cada tamaño) y de 2,5 cm de largo pedazo de sutura de seda 6-0 para la interconexión de las mitades en el sitio de la oclusión de la carótida. </li><li> Desinfectar el campo operatorio con generosa cantidad de Betadine. Use tijeras afiladas pequeña para abrir la piel y la fascia del cuello mediante una incisión medial 4 a 5 mm desde la parte superior del esternón (manubrio). </li><li> Ampliar la apertura, shift la glándula parótida derecha a un lado e inserte un separador quirúrgico. A continuación, sin rodeos diseccionar a lo profundo, a la izquierda de la tráquea (desde la vista de los cirujanos), donde el músculo sternomastoideus derecha cruza el músculo omohioideo derecha, hasta que son capaces de identificar la palpitante arteria carótida común derecha. </li><li> El uso de pinzas en ángulo o curvas muy finas (por ejemplo, Dumont n º 5 / 45), disección de la arteria carótida común derecha removiendo suavemente el tejido conectivo circundante. Separar la carótida del nervio vago - el objeto blanco y fibroso que corre directamente a lo largo de la carótida - ya que este paso es necesario para exponer completamente el recipiente. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago, ni una rama de la vena yugular interna izquierda, que está también en estrecha relación con la carótida. </li><li> Con el fin de elegir el manguito de tamaño apropiado, comparar el diámetro de la arteria carótida expuesta con el diámetro interior de las conchas medio del manguito: La mayor anchura de la luz debe cumplir con los puños diámetro exterior de la carótida. </li&gt; <li> Ahora, con cuidado coloque la punta de la pinza en la carótida, abra las pinzas, hilo de la pieza de sutura de seda 6-0 en la carótida y la forma de un bucle. Entre el lazo y el lugar de la carótida una cáscara debajo de la media del manguito de la carótida. El lado de los más grandes reducción ha de ser posterior. </li><li> Coloque la cáscara del manguito de la segunda mitad dentro del bucle en la parte superior de la carótida. </li><li> Apriete suavemente el lazo de sutura con las pinzas de sutura y el nodo de la rosca. De esta manera el corte funcionamiento modificador de estrés se forma. Para el ajuste preciso de la banda, es esencial que la sutura se ejecuta exactamente en la ranura preformada en la superficie exterior del manguito. </li><li> Mueva la glándula parótida derecha de nuevo en su posición original, aproximadamente y cerca de la piel, ya sea usando una pequeña cantidad de sutura de prolene 6-0, o bien, puede utilizar los clips de heridas. </li><li> Inyectar una dosis única de 5 mg / kg de carprofeno (Rimadyl por ejemplo) por vía subcutánea para proporcionar el tratamiento del dolor profiláctico y el lugarel ratón en una cámara de calentamiento hasta que se recupere. Normalmente, esto toma 30-60 minutos cuando se utiliza anestesia ketamina / xilazina. Al usar la inhalación de isoflurano el período de recuperación es mucho más corta (10-20 min). </li><li> En nuestra experiencia, los animales recuperan la normalidad en la actividad sin tensión las primeras 24 horas después de la implantación del manguito con la intervención que se realiza por un cirujano experimentado. Sin embargo, si el animal parece estar en dificultades, incluso un día después de la cirugía, repetir el tratamiento analgésico y consulte con el personal veterinario. </li></ol> 3. Explante del manguito y las arterias carótidas <ol><li> Para el análisis histológico de las arterias carótidas que se cosecha al final del período de observación. Antes de comenzar la explantación, el animal tiene que ser sacrificado de acuerdo con las directrices IACUC. </li><li> Si los depósitos medio del manguito están destinados a la reutilización, retirar con cuidado los fragmentos de tejido y la sutura de conexión de los elementos plásticos, dissecting de las arterias carótidas, lavar y guardar las cáscaras de media en la solución de alcohol al 70%. Se debe tener en cuenta que la banda está integrada en las adherencias del tejido conjuntivo después de varias semanas de implantación y que hay que disecar el manguito con precaución para no dañar las paredes del recipiente. </li><li> Por otra parte, la banda puede ser explantados e integrados junto con la arteria carótida. El material plástico de la banda es resistente a las soluciones de fijación normal y disolventes utilizados para la inclusión en parafina. Además, las muestras incrustado se puede cortar con un microtomo normales equipados con cuchillas normales. </li></ol> 4. Resultados representante El manguito debe colocarse siempre en torno a una de las dos arterias carótidas comunes de un animal (Fig. 1A, 1B) - en el lado contralateral sirve como control. En la imagen de la presentación de las dos mitades del manguito (Fig. 1B) de la forma cónica de la luz interior es visible. Esta forma cónica es esencial para establishing las tres regiones con la dinámica de flujo diferentes. Los patrones típicos de esfuerzo cortante inducida por el elenco calcula a partir de las mediciones Doppler 11 y las velocidades de flujo correspondiente basado en la velocidad de imagen de contraste de fase MR 12 se presentan en la Figura 2. Cuando la banda se implanta en ratones ApoE alimentados con una dieta de tipo occidental el flujo alterado la dinámica de provocar tensión cortante inducida por la deposición placa aterosclerótica (Fig. 3): Aguas arriba de la constricción cónica de baja tensión de corte laminar conduce a un desarrollo masivo de las placas de ateroma de una más fenotipo vulnerable, caracterizado por núcleos de lípidos cerca de la luz central, cubierto sólo por una capa fibrosa fina (Fig. 3A1). La luz interior cónica del manguito conduce a un aumento en la velocidad del flujo. Casi no hay deposición de la placa se observa en esta área. Directamente aguas abajo del sitio del cuello de botella de la inmediata ampliación de los resultados de la arteria en un área de vórtices y oscilatorio flow parámetros, lo que provoca el desarrollo de la placa menos extendido de un fenotipo más estables (es decir, menos núcleos de lípidos que se localizan más cerca de los medios de comunicación). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3308/3308fig1.jpg" /> Figura 1 El modificador de esfuerzo cortante - montaje y colocación (A) Esquema de la banda implantados:.. La banda se coloca alrededor de la arteria carótida común derecha (RCCA) - en el lado contralateral (ACCV = arteria carótida común izquierda) sirve como control . (B) En vivo angiografía MRI en un ratón: En la proyección de máxima intensidad de una imagen tridimensional de tiempo de vuelo de angiografía por resonancia magnética de la constricción cónica inducida por el elenco (flecha blanca) es visible (para más detalles véase 12). (H = altura, F = pies, D = derecha, L = izquierda). En la esquina superior derecha una visión macroscópica de la luz interior y la superficie exterior de las conchas de medio puño se le da. Una vez montado, dos mitades forman un cilindro cónico que se modificala dinámica del flujo dentro del vaso de una manera definida. Para asegurar el ajuste correcto, un surco en la superficie exterior del manguito (flecha amarilla) sirve como una guía para la sutura de unión. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3308/3308fig2.jpg" /> Figura 2. Regiones de la dinámica de flujo diferente y el esfuerzo cortante. Implantación de la dinámica del flujo del manguito y el estrés altera posteriormente corte en la arteria carótida restringido de una manera definida. En la ilustración esquemática superior de las propiedades de flujo diferentes y se indican los valores locales aproximado de esfuerzo cortante se dan (en base a las mediciones Doppler 11). A continuación, correspondientes velocidades de flujo para un solo animal, medido por resonancia magnética aguas arriba de la banda implantados se muestran en una T1 transversal resonancia magnética, las imágenes del cuello (de contraste de fase imágenes de velocidad, para más detalles véase 12). Figura 3. Esfuerzo cortante inducida por el desarrollo de placas en ratones ApoE. En la esquina superior izquierda muestra el punto de vista macroscópico en el cuello abierto y expuesto las arterias carótidas de un ratón knockout ApoE en alto grado en grasas (tipo occidental) dieta 8 semanas después de la implantación de un esfuerzo cortante modificador de alrededor de la arteria carótida común (RCCA). La región de color blanco opaco de la embarcación (*) aguas arriba de la banda corresponde a un sitio de deposición extensa placa aterosclerótica. La flecha amarilla indica que el hilo que combina las dos mitades del manguito. Por el contrario, no hay signos de deposición de la placa en la arteria coronaria común (ACCV). (A) - (C) Representante manchó las secciones transversales de la arteria carótida común derecha de un ratón knockout ApoE en la dieta de tipo occidental 8 semanas después de la implantación de la banda. La ilustración esquemática ofrece los planos correspondientes (líneas punteadas) RCEste las secciones se encuentra. (A) antes de la aterosclerosis manguito conduce a la deposición de la placa masiva. Grandes núcleos de lípidos (flechas rojas), que en parte se encuentran cerca de la luz central (detalle A1) caracterizan el carácter vulnerable de estas placas. (B) En el plano del cuello de botella del manguito casi ningún desarrollo de la placa es evidente, mientras que directamente aguas abajo de la banda (C) flujo oscilatorio lleva a moderado desarrollo de la placa de un tipo más estable (es decir, menos o nada de los núcleos de los lípidos). (C1, C2 = conchas de la mitad de la banda, P = placas, asterisco = luz del vaso)

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	<li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium:+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives.">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Lab. Invest. 85, 9-23 (2005).</li><li>Ali, F., Zakkar, M., Karu, K., Lidington, E. A., Hamdulay, S. S., Boyle, J. J., Zloh, M., Bauer, A., Haskard, D. O., Evans, P. C., Mason, J. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Con el fin de minimizar la variación experimental se recomienda trabajar con animales de casi la misma edad y con la historia misma dieta. Una investigación recientemente publicado demuestra que el modificador de esfuerzo cortante aplicado en ratones de tipo salvaje podría ser un buen modelo para la investigación de la disfunción endotelial y principios de la respuesta inflamatoria inducida por la alteración de la dinámica de flujo 13. Sin embargo, para la investigación de la placa aterosclerótica de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Modificador de esfuerzo cortante (polyetherketone) </td><td> Promolding BV <a href="http://promolding.nl">http://promolding.nl</a> </td><td> Los moldes son enviados al mismo tiempo conectado a los corredores. Por lo tanto, los elementos individuales tienen que ser cortada antes de su uso. </td></tr></tbody></table>

implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice

Es ampliamente aceptado que las alteraciones en la tensión de cizallamiento vascular activar la expresión de genes inflamatorios en las células endoteliales y por lo tanto inducen la aterosclerosis (revisado en 1 y 2). El papel de la tensión de corte ha sido ampliamente estudiado in vitro la investigación de la influencia de la dinámica de flujo en las células endoteliales cultivadas 1,3,4 e in vivo en animales de mayor tamaño y los seres humanos 1,5,6,7,8. Sin embargo, los pequeños modelos animales altamente reproducible que permita una investigación sistemática de la influencia del esfuerzo cortante en el desarrollo de la placa son poco frecuentes. Recientemente, Nam et al. 9 introducen un modelo de ratón en el que la ligadura de las ramas de la arteria carótida crea una región de bajo flujo y oscilatorio. Aunque este modelo hace que la disfunción endotelial y la formación rápida de las lesiones ateroscleróticas en ratones hiperlipidémicos, no se puede excluir que la respuesta inflamatoria observada es, al menos en parte, una consecuencia of endoteliales y / o daño de los vasos debido a la ligadura. A fin de evitar estas limitaciones, un manguito de tensión de corte modificando ha sido desarrollado basándose en la dinámica de fluidos calculado, en forma de cono cuya luz interior fue seleccionado para crear regiones definidas de baja tensión, de corte alto y oscilante dentro de la arteria carótida común 10. Mediante la aplicación de este modelo en ratones knockout de apolipoproteína E (ApoE) alimentados con una dieta alta en colesterol de tipo occidental, las lesiones vasculares se producen aguas arriba y aguas abajo de la banda. Su fenotipo se correlaciona con la dinámica del flujo regional 11, confirmada por imágenes en vivo por resonancia magnética (MRI) 12: tensión de corte baja y laminar aguas arriba de la banda hace que la formación de placas extensas de un fenotipo más vulnerables, mientras que la oscilación descendente de la tensión de corte el manguito induce lesiones ateroscleróticas estables 11. En las regiones de alta tensión de corte y flujo laminar de alta dentro de la banda,por lo general no se observan las placas de ateroma. En conclusión, el esfuerzo de corte, modificando el procedimiento del manguito es un método fiable quirúrgica para producir las lesiones ateroscleróticas fenotípicamente diferentes en los ratones deficientes en ApoE.

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Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

El manguito de constricción se presenta en este artículo está diseñado para inducir a la aterosclerosis en la arteria carótida común murino. Debido a la forma cónica de su luz interior del manguito implantado genera regiones bien definidas de baja tensión, alta cizalla oscilatoria y activar el desarrollo de lesiones ateroscleróticas de los diferentes fenotipos inflamatorios.

Implantación de un manguito de la carótida para provocar esfuerzo cortante aterosclerosis inducida en ratones

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

implantation-carotid-cuff-for-triggering-shear-stress-induced

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K vistas.  Westfälische Wilhelms-University Münster. El manguito de constricción se presenta en este artículo está diseñado para inducir a la aterosclerosis en la arteria carótida común murino. Debido a la forma cónica de su luz interior del manguito implantado genera regiones bien definidas de baja tensión, alta cizalla oscilatoria y activar el desarrollo de lesiones ateroscleróticas de los diferentes fenotipos inflamatorios.