Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte a nivel mundial. Los modelos de ratón son herramientas útiles para estudiar esta enfermedad y nuestro protocolo se puede utilizar para cuantificar la aterosclerosis en ratones. Con este protocolo, el tamaño de la lesión se puede medir en tres lugares vasculares.
La raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala. La cuantificación de la aterosclerosis en ratones puede ser una tarea tediosa. Hemos proporcionado pasos detallados que esperamos puedan acelerar el proceso.
Algunos de estos pasos son difíciles de describir por escrito. Esperamos que este video le ayude a obtener un análisis robusto del tamaño de la lesión aterosclerótica. Después de cosechar un corazón de ratón de acuerdo con los protocolos estándar, coloque el corazón en un lecho de corcho, el lado ventral hacia arriba bajo un microscopio diseccionado y use una aguja para fijar el corazón al corcho a través del ápice.
Sosteniendo la base del corazón con fórceps anatómicos, utilice un bisturí mantenido en un ángulo de 20 grados caudalmente en el plano sagital, y 20 grados cránidalmente en el plano transversal, para cortar los dos tercios apicales del corazón. Incrustar la raíz aórtica y la base del corazón en el compuesto de temperatura de corte óptima, o OCT, y apretar suavemente el corazón con los fórceps para llenar la raíz aórtica con compuesto y para eliminar cualquier burbuja de aire. Transfiera la muestra al fondo de un criomold lleno de OCT con la raíz aórtica perpendicular a la superficie inferior y congele el compuesto en hielo seco.
A continuación, almacene la muestra de tejido en una bolsa de congelador a menos 80 grados Centígrados hasta criocisar. Para preparar una cama de fijación para el análisis de la cara, doble un segmento de película de cera de parafina ocho veces para hacer una superficie plana de 25 por 25 mm y envolver la cinta de aislamiento eléctrico negro alrededor de la película para hacer un fondo oscuro para la aorta. Coloque una etiqueta en la parte posterior de la cama anclada y utilice un lápiz de plomo para registrar el número de identificación del ratón.
Transfiera el arco aórtico a la cama de fijación y agregue una gota de PBS al tejido. Con un microscopio estéreo, limpie la aorta del tejido adiposo periadventitial restante y utilice tijeras Vannas y fórceps Dumont para despegar suavemente todo el tejido adiposo circundante sin manipular ni dañar la aorta. A continuación, introduzca las tijeras Vannas en el lumen aórtico para exponer la superficie intimal.
Comience a cortar la curvatura exterior del arco ascendente en la dirección distal, continuando cortando las ramas, incluyendo la arteria braquiocéfala y ahorrando la parte dorsal de la región torácica descendente. Para mostrar la superficie intimal, abra la curvatura menor y abra la aorta. Usando un soporte de aguja micro Castroviejo, fije el arco abierto al lecho de fijación con el extremo romo de los pines de insectos minados sin estirar la muestra, doblando suavemente los alfileres lejos de la muestra mientras el tejido se mantiene en su lugar.
A continuación, guarde el arco anclado boca abajo en un plato Petri de PBS a cuatro grados Centígrados. Para la tinción de Sudán IV, enjuague el espécimen durante cinco minutos en un plato de Petri de 70% etanol con el arco hacia abajo, antes de transferir el espécimen a un plato de solución de trabajo de Sudán IV durante siete minutos. Al final de la incubación, enjuague la muestra con dos lavados de tres minutos en 80%etanol para desmantellar la superficie normal de intimal, seguido de un enjuague final en PBS antes de devolver el tejido a su plato original de Petri.
A continuación, adquiera micrografías bajo un microscopio estéreo conectado a una cámara digital con un aumento de 10X, obteniendo imágenes del arco anclado sumergido en PBS, utilizando pequeños pesos metálicos para sujetar la cama anclada a la parte inferior de la placa Petri. Para obtener criocciones de la raíz aórtica incrustada, establezca la temperatura del criostato en menos 20 grados Celsius y el espesor de la sección en 10 micrómetros. Monte el bloque OCT que contiene la raíz aórtica en el soporte de la muestra con el tejido ventricular orientado hacia afuera.
Asegure el posicionamiento con algunos OCT adicionales si es necesario. La raíz aórtica ahora debe colocarse perpendicular a la hoja del cuchillo. Recoger las secciones de control inicial que contienen tejido muscular del corazón en diapositivas de microscopio ordinarios, comprobando la progresión a través del tejido cada 200 micrómetros bajo un microscopio de luz.
Cuando aparezca la primera cúspide aórtica, incline la muestra hacia la cúspide cero del punto para alinear el plano de sección con las otras dos cúspides y contar cada sección de 10 micrómetros que se corte desde el punto cero en adelante. Comience a recoger secciones para su análisis a partir de 90 micrómetros de acuerdo con la diapositiva planificada, hasta que se hayan alcanzado 800 micrómetros desde el punto cero. El cálculo de la fracción de lesión del área total del recipiente de la raíz aórtica hace que los datos sean menos sensibles a las posibles diferencias de ángulo durante el seccionamiento.
Además, podría ser ilustrativo calcular el área debajo de la curva o el tamaño de la lesión atheroto por ratón y presentar los datos en una gráfica de puntos para visualizar más las variaciones individuales dentro de los grupos. La acumulación de lípidos lesionales se puede cuantificar mediante el umbral de color rojo O áreas positivas de la zona total de la lesión. Las arterias coronarias derecha e izquierda generalmente difieren de la aorta alrededor de 250 micrómetros del seno aórtico que a menudo coincide con los tamaños de lesión más prominentes.
La eliminación del fondo oscuro en imágenes representativas de los arcos aórticos en face puede mejorar la visualización visual. El tamaño de la lesión se distribuye normalmente dentro de los grupos, lo que permite el análisis estadístico utilizando la prueba t del estudiante entre grupos. Recomendamos practicar con algún material de prueba hasta que haya obtenido suficientes habilidades para procesar sus muestras experimentales.
Si el tamaño de la lesión es diferente entre los grupos, debe determinar el mecanismo, ya que un análisis de la composición de la lesión suele ser el siguiente paso a seguir.
