Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología endotelial, como ¿por qué los vasos sanguíneos tienen diferencias regionales en el desarrollo de la aterosclerosis? La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio simultáneo de múltiples condiciones bajo tensión de cizallamiento o condiciones de tensión de cizallamiento múltiple. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión de la regulación del gen endotelial en los sistemas arterial y venoso porque se pueden utilizar diversos caudales y patrones.
Bueno, aquí, demostramos un sistema que utiliza un flujo laminar constante. La configuración se puede adaptar para otros patrones de flujo, incluido el flujo perturbado. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades para mantener una monocapa continua de células a lo largo de la duración del experimento y para obtener resultados consistentes entre experimentos.
24 horas antes del análisis, contar las células endoteliales humanas en un pasaje temprano y sembrar aproximadamente una vez 10 a las sextas células en un mililitro de medio en un portaobjetos recubierto de fibronectina por pozo de una placa de cultivo celular de cuatro pozos. Deje que las células se adhieran a la diapositiva durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, cubra cada diapositiva con tres mililitros de medio y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular de 37 grados centígrados y 5%CO2 durante 24 horas.
El día del experimento, llene la bandeja de agua de un entorno grande, calentado y incorporado con CO2 ajustable y calor, o incubadora de playa, con múltiples estantes, acceso interno a la electricidad y puertas de vidrio, y confirme que hay dióxido de carbono adecuado disponible para el experimento, y que el monitor de CO2 es funcional. Para configurar la cámara de flujo, inserte un señuelo hembra de 1/8 pulgadas en un extremo de un tubo blando número 16, y conecte un llavero de cuatro vías al señuelo. Fije el extremo libre del tubo al lado de entrada de la placa superior e inserte un señuelo macho de 1/8 de pulgada en un extremo de un segundo tubo blando número 16.
Coloque un llavero de cuatro vías en el señuelo macho y conecte el extremo libre del tubo al lado de salida de la placa superior. Inserte un señuelo macho de 1/8 de pulgada y un señuelo hembra de 1/8 de pulgada en cada extremo de un tercer tubo blando número 16, y conecte el tubo a una trampa de burbujas a través del señuelo macho de 1/8 pulgadas. A continuación, coloque un llavero de cuatro vías en el otro extremo del tubo a través del señuelo femenino.
Usando pinzas estériles, transfiera una diapositiva de vidrio de semilla de celda al hueco en la placa inferior, celda sin semillas hacia arriba. Utilice una jeringa de 10 mililitros para añadir 10 mililitros de medio caliente a la placa inferior dentro de la línea de junta roja alrededor de la placa. Permitiendo que el medio fluya a través de la diapositiva y cubra las celdas.
Coloque suavemente la placa superior en la placa inferior teniendo cuidado de alinear los lados y atornillar las placas firmemente. Para eliminar las burbujas de aire de la trampa de burbujas, primero abra los stopcocks de la trampa de entrada y burbuja y cierre el semá cerca de la salida. A continuación, utilice una jeringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de medio caliente a través de la placa.
Para eliminar las burbujas de la cámara, cierre el tapón de la trampa de la burbuja y abra el llave de salida. Elevar el lado de salida de la cámara a un ángulo de 45 grados y utilice la jeringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de medio caliente desde el lado de entrada de la cámara. Es importante enjuagar a una velocidad adecuada en la dirección del flujo y utilizar el microscopio para confirmar que una monocapa confluente de células permanece antes de exponer las células al flujo laminar.
A continuación, cierre los llaveros a ambos lados de la cámara y la tapa y confirme que las células todavía están unidas a la diapositiva bajo un microscopio de luz. Coloque la cámara de flujo y un sistema de bucle de flujo previamente montado en la playa y disminuya lentamente la velocidad de la bomba del conjunto del bucle de flujo antes de pausar la bomba por completo. Cierre los llaveros del sistema de bucle de flujo para evitar fugas y conecte la cámara y el sistema de bucle a través de llaves.
Cuando todos los bucles se hayan conectado, vuelva a abrir todos los llaveros y aumente lentamente la velocidad de la bomba mientras supervisa la configuración de cualquier fuga o bloqueo. Coloque el sensor de flujo en el tubo del puente de la cámara del lado de entrada de la cámara con el sensor orientado en la dirección del flujo y ajuste la velocidad de la bomba para obtener el caudal para la tasa de tensión de cizallamiento de interés. A continuación, encienda el tanque de CO2 para lograr una concentración de 5%C02.
Una vez completado el período de flujo experimental, disminuya lentamente la velocidad de la bomba peristáltica a cero y apague la alimentación. Cierre rápidamente todos los llaveros abiertos y transfiera la cámara y el tubo adjunto con un llavero a cada lado a una mesa de trabajo limpia. Desenrosque cuidadosamente todos los tornillos para quitar la placa superior y utilice pinzas de punta de aguja para transferir el portaobjetos de vidrio de la placa inferior a un plato de 100 milímetros de diámetro.
Lave el portaobjetos en 10 mililitros de PBS frío y compruebe las células bajo un microscopio para confirmar la adherencia y alineación celular en la dirección del flujo. Después de aspirar el PBS, transfiera la diapositiva a una placa limpia de 100 milímetros de diámetro y agregue 350 microlitros de tampón de lelisis complementados con 1/100 de Beta-Mercaptoetanol de un kit de extracción de ARN a la diapositiva. Utilice un rascador de células con cuchillas de polietileno para raspar las células de la diapositiva e inclinar la placa de cultivo de tejido para permitir que el tampón se apete en la parte inferior.
Utilice fórceps para extraer el portaobjetos y pipetear el lito de celda en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, agregue 10 microlitros de ARN de luciferasa diluido al lisoto celular para el aislamiento y análisis de ARN aguas abajo de acuerdo con los protocolos estándar. Una linealización exitosa del plásmido de luciferasa utilizando enzimas de restricción se puede confirmar ejecutando los productos digeridos en un gel de agarosa y el tamaño del producto linealizado se puede confirmar con escaleras de ADN y en comparación con un plásmido sin cortar.
Los procesos de fabricación pueden dar lugar a pequeñas variaciones en la altura de la cámara, por lo que el caudal debe calcularse para cada cámara para lograr la misma tensión de cizallamiento. Para los experimentos que incorporan estrés de cizallamiento laminar en células endoteliales de mamíferos, el ARN de la luciosa de luciérnaga se puede utilizar como un pico de ARN exógeno. La normalización del gen de referencia endógeno, el gen de referencia exógeno y los genes de referencia endógenos y exógenos juntos producen resultados similares.
Cabe destacar que en estos experimentos representativos utilizando dos cámaras de flujo simultáneamente en funcionamiento con tensión de cizallamiento en un Pascal para cada experimento, Kruppel como el factor dos derribo a través de SI-RNA produjo una eficiencia de derribo similar entre las muestras biológicas probadas. Al intentar este procedimiento es importante recordar establecer una monocapa uniforme de celdas en la diapositiva y profusar el sistema de bucle de flujo antes de conectar la cámara de flujo. Después de este procedimiento, otros métodos, como la secuenciación de ARN, se pueden utilizar para evaluar la expresión de ARN amplia del genoma y otras lecturas, como EL ADN y las proteínas, se pueden utilizar para un análisis molecular adicional.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología endotelial exploraran la relación entre el estrés de cizallamiento y el potencial angiogénico en las células endoteliales humanas.
