Los autores desean agradecer a todos los miembros de Jarvis de laboratorio que mejoraron el protocolo a través de los años.

<ol>
	<li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain.">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li><li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization.">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li><li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor-driven+gene+expression.">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li><li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain.">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li><li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections:+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol.">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li><li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons.">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li><li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections.">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li><li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain.">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li><li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes.">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li><li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus.">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li><li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity.">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363 (2005).</li><li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds.">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li><li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bird+sings:+context-dependent+gene+expression.">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li><li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain:+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin.">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768 (2008).</li><li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization.">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Radiactivos hibridación in situ de la expresión del ARNm es ampliamente utilizado para múltiples propósitos, incluyendo para el estudio de la organización del tejido regional, tipos de células, y la actividad funcional del cerebro 2-5,10,12-14. El uso posterior está en los genes cuya expresión de ARNm en el cerebro depende de una mayor actividad neuronal, a menudo llamados los genes dependientes de la actividad o de genes tempranos inmediatos. Con esta finalidad, nuestro método ha sido aplicado a través de múltiples especies, en particular en las aves, los mamíferos (humanos), los peces y los anfibios; en varios tejidos, incluyendo cerebro, piel y músculo, y de edades múltiples, incluyendo los neonatos o recién nacidos, menores de edad , los adultos, y aquí, en secciones de embriones enteros 2,3,5,15-17. Las características especiales de nuestro protocolo incluyen: (1) Se produce un equilibrio entre la especificidad anatómica y la especificidad cuantitativa. Para cuantificar la expresión génica en la película de rayos X, tomamos fotografías digitales de las imágenes (por ejemplo:. Fig. 1A y 1B), utilice el Photoshop (Adobe) la función de histograma para medir la densidad de píxeles en las regiones de interés y restar los niveles de fondo de la película fuera de los tejidos, pero todavía en el portaobjetos de vidrio 2,4. Para cuantificar la expresión a nivel celular, tomamos las imágenes de los granos de plata sobre las células con gran aumento (40-100X, Fig. 4). A continuación, utilizamos el umbral y las funciones de medida de la J de la imagen de Wayne Rasband en los NIH para contar el número de granos de plata en la imagen, se resta el recuento de fondo en un área similar sin células de la lámina de vidrio, se divide por el número de células, para obtener valores de expresión por célula. 4,18 (2) Se puede medirse el flujo relativamente alta, permitiendo el procesamiento de 100-200 diapositivas simultáneamente, debido a la junta de cubreobjetos apretado creado por el baño de aceite mineral. Standard in situ los métodos de hibridación tomar más tiempo para sellar los portaobjetos con parafina, esmalte de uñas, y otros medios, donde las diapositivas ocupan mucho espacio, (3) Es muysensible para transcripciones de baja abundancia debido a sulfato de dextrano y solución de Denhardt en el tampón de hibridación 2,13; (4) El enfoque de imágenes en campo oscuro produce imágenes de alto contraste, debido a la toma de fotografías bajo iluminación en campo oscuro en un microscopio de disección 4,5. Además, permite la detección sensible de los pequeños cambios en la expresión génica, tales como en la expresión génica dependiente de la actividad para identificar regiones específicas del cerebro activadas durante la percepción y la producción de comportamientos específicos 19. Las limitaciones relativas a no radiactivos protocolos son que los últimos son más clara en la resolución celular y la localización del ARNm dentro de la célula, y trabajando con emulsión es muy sensible a la manipulación y la luz. Es posible combinar nuestro método con otros métodos, tales como no radiactivos en hibridación in situ para etiquetar la expresión del ARNm de más de un gen en el mismo tejido 10,17,20. Se puede combinar con inmunocitoquímicapara etiquetar ambos ARN y la expresión de proteínas en la misma muestra con el fin de co-localizar el ARNm con ciertos tipos de células 10. Las modificaciones de protocolo necesarios para tales experimentos de marcaje doble se describen en las referencias citadas. En resumen, nuestro enfoque facilita la comprensión del momento y la localización celular de la expresión génica con el fin de entender la organización la región, la actividad del tejido funcional, y la función del gen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> El anhídrido acético </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de violeta de cresilo </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida desionizada </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Incrustación de molde </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marca Superfrost Plus diapositivas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN kit </td><td> Q-Bio gen </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Biomax MR película </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsión </td><td> Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Developer D19 </td><td> Kodak </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Fixer </td><td> Kodak </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poli A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Seguridad-Solve solución </td><td> Resolver Investigación de Productos de Seguridad Internacional </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Fosfato sódico dibásico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato sódico monobásico </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6ARN polimerasa </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> La tinción parrilla de metal </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 ARN polimerasa </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek octubre </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Transcripción tampón 5x </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolamina </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Soluciones: <ol><li> Reactivos para la fabricación de riboprobes: 1,5 l de ADN plantilla (0,2-0,3 g / l), 2 l de tampón 5x transcripción optimizado, 1 l de DTT 100 mM (viene con la polimerasa de Promega, la mezcla depocillo a temperatura ambiente), 0,3 l de RNasin (40 unidades / l), 1,5 l de solución de AGC mezcla ribonucleótido, 3,5 l de S 35 UTP, y 1 l ARN polimerasa. Lleve hasta 10 ml con agua libre de nucleasa. </li><li> Ribonucleótido AGC mezcla de solución: mezclar cantidades iguales de 10 mM de ATP, GTP y CTP juntos. </li><li> Solución de acetato de sodio para EtOH precipitación para eliminar 35 S libre UTP: 40 l RNasa y DNasa agua libre, 5 l de acetato sódico 3M, y 125 l de EtOH al 100%. </li><li> Hibridación tampón (10 ml stock): 5 ml de 100% de formamida desionizada, 600 l de NaCl 5M, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 l de EDTA 0,5 M (pH = 8,0), 100 l de solución de Denhart 100x, 100 l de 1M TDT, 250 l de 20mg/ml ARNt, 125 l de 20 mg / ml de poli A, y 1 g de sodio sulfato de dextrano. Añadir agua tratada con DEPC para llevar el volumen total a 10 ml. Agitar vigorosamente y luego se incuba a 55 ° C hasta que todo el sulfato de dextrano sódico se disuelve. Almacenar el tampón de hibridación en el-20 ° C, lo que es bueno para ~ 6 meses. </li><li> 4% tamponada solución de paraformaldehído: Añadir 40 g de paraformaldehido en 760 ml de agua destilada en un matraz designado para paraformaldehído, el calor a 50 ° C sobre una placa caliente mientras se agita. Añadir 320 l de NaOH 10N para ayudar a disolver el paraformaldehido. Después de la disolución (~ 10 minutos), añadir 100 ml de PBS 10x, y llevar el volumen con agua destilada hasta 1 litro. Agitar y calentar la solución hasta que se disuelve paraformaldehído. El pH debe ser 7,4. </li><li> La acetilación tampón: 13,6 ml de trietanolamina además 2,52 ml de anhídrido acético en 1 litro de agua destilada. </li><li> 20x SSPE solución: 3M NaCl, 200 mM NaH 2 PO 4-H 2 O, y 200 mM EDTA en agua destilada. Ajuste solución a pH 7,4 con NaOH 10N. </li><li> 10x tampón PBS: 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, y 2,4 g de KH 2 PO 4 en agua destilada. Ajuste solución a pH 7,0 y llevar el volumen total a 1 Liter. </li><li> Segunda solución de lavado: 0,1% β-mercaptoetanol y 50% de formamida en 2x SSPE </li><li> Violeta de cresilo solución de acetato: 3% de acetato de violeta de cresilo en agua del grifo (agua destilada evita buena tinción), se disolvió durante la noche con agitación en un matraz a temperatura ambiente. Filtrar por succión de vacío a través de un papel de filtro Whatman 1 mm y un embudo de Buchner. </li></ol>

radioactive in situ hybridization for detecting diverse gene expression patterns in tissue

Conociendo el tiempo, nivel, localización celular, y el tipo de células que un gen se expresa en contribuye a la comprensión de la función del gen. Cada una de estas características se puede lograr con la hibridación in situ a ARNm en las células. Aquí les presentamos una radiactivo en el método de hibridación in situ modificado a partir de Clayton et al. (1988) 1, que ha estado trabajando con éxito en nuestro laboratorio desde hace muchos años, especialmente para los adultos cerebro de un vertebrado 2-5. Los largos ARN complementario (cRNA) sondas a la secuencia diana permite la detección de las transcripciones de baja abundancia 6,7. La incorporación de nucleótidos radiactivos en las sondas cRNA permite la sensibilidad de detección adicional de las transcripciones de baja abundancia y análisis cuantitativos, ya sea por la luz sensible película de rayos X o emulsión revestido sobre el tejido. Estos métodos de detección de proporcionar un registro a largo plazo de un gen determinado. En comparación con los no radiactivo de la sonda de metanfetaminamétodos, como DIG-etiquetado, el método de sonda de hibridación radiactiva no requiere de varios pasos de amplificación utilizando HRP-anticuerpos y / o kit de la TSA para detectar la transcripción de baja abundancia. Por lo tanto, este método proporciona una relación lineal entre la intensidad de señal y las cantidades específicas de mRNA para el análisis cuantitativo. Se permite el tratamiento 100-200 diapositivas simultáneamente. Funciona bien para diferentes etapas de desarrollo de los embriones. Mayoría de los estudios de desarrollo de la expresión génica utilizar embriones enteros y los enfoques no radiactivos 8,9, en parte porque el tejido embrionario es más frágil que el tejido adulto, con una menor cohesión entre las células, lo que hace difícil ver los límites entre las poblaciones de células con las secciones de tejido. En contraste, el enfoque radiactivos, debido a la mayor gama de sensibilidad, es capaz de obtener un mayor contraste en la resolución de la expresión génica entre las regiones de tejido, por lo que es más fácil de ver los límites entre las poblaciones. El uso de este método, los investigadores podrían revelar laposible significado de un gen recién identificado, y además predecir la función del gen de interés.

Watch this Scientific Journal Video about Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue at JoVE.com

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Este protocolo se utiliza con éxito para detectar cuantitativamente los niveles y los patrones espaciales de la expresión del ARNm de múltiples tipos de tejidos a través de las especies de vertebrados. El método puede detectar transcripciones baja abundancia y permite el tratamiento de cientos de diapositivas simultáneamente. Se presenta el protocolo de uso de perfiles de expresión de la formación del cerebro del embrión aviar como ejemplo.

Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

15.5K vistas.  Duke University. Este protocolo se utiliza con éxito para detectar cuantitativamente los niveles y los patrones espaciales de la expresión del ARNm de múltiples tipos de tejidos a través de las especies de vertebrados. El método puede detectar transcripciones baja abundancia y permite el tratamiento de cientos de diapositivas simultáneamente. Se presenta el protocolo de uso de perfiles de expresión de la formación del cerebro del embrión aviar como ejemplo.