A PHS Grant (MH51393) bu çalışmalarını desteklemiştir. Kullandığımız Aplysia&#39;nın Bazı Araştırma Kaynakları, NIH National Center for Grant RR10294 altında Miami Üniversitesi Aplysia&#39;nın için Ulusal Kaynak tarafından sağlanmaktadır.

1. Hazırlık <ol><li> 75-100 ml izotonik magnezyum klorid çözeltisi enjekte edilerek hayvan anestetize. Biz görüntüleme için kullanmak Aplysia&#39;nın genellikle 150-200 gram ve Marinus Bilimsel elde edilir. </li><li> Bir balmumu kaplı çanak anestezi hayvan Pin. Şırınga iğneleri bu amaç için iyi çalışır; steril teknikler gerekli değildir. Brüt forseps ve standart makas kullanarak hayvanın ayağı bir kesi yapmak ve bukkal kitle maruz. Bukkal ganglion bulun. Tüm bukkal sinirler kesilerek ganglion dikkatle ücretsiz, yay makas ve ince forseps kullanma. </li><li> Ganglion çıkarın ve yapay deniz suyu içeren bir Sylgard astarlı çanak yerleştirin. Ganglion stabilize bukkal sinirler aracılığıyla birkaç böcek işaretçilerine yerleştirin. Desheath intrasellüler kayıt için nöronlar maruz ultra ince forseps ve yaylı makas, böylece kullanarak bukkal ganglion. Sonra yaklaşık 15 ince böcek (kullanarak ganglion re-pin minutien) işaretçilerine. Herhangi bir hareket görüntüleme sırasında sorunlu olacak gibi gangliyon sıkıca tutulmalıdır. </li></ol> 2. Elektrotlar hazırlayın <ol><li> Filament cam kapiller tüp kullanarak elektrotlar (örneğin TEFE TW100F-4) ve bir çektirmesi çekin. Ayarları ayrı ayrı istenilen direnç elektrodlar oluşturmak için kararlı olmalıdır. Elektrotlar eğimli olabilir, ya da yaklaşık 5 MOhms eğim verme aşaması atlanmıştır durumunda ise 3 M KAC ile dolu olduğunda (potasyum asetat) bizim elektrot direnci 10 MOhms yaklaşık genellikle. </li><li> Bir şırınga ve bir iğne kullanılarak Mikrofil 3 M KAc/30 mM KCI ihtiva eden bir çözelti ile elektrot arasında bir set doldurun. Bu elektrotlar elektrofizyoloji için kullanılacaktır. </li><li> , Boya de elektrodun arka ucu ile daldırma kalsiyum gösterge boya ile elektrot ikinci bir set dolgu önceden yaklaşık ile sulandırılır. 500 ug boya için 40 ul distile su. Elektrodun ucunda dolu sonra, geri yaklaşık 1/4 inç doldurmakiyi elektriksel temas sağlamak için KCl 200 mM elektrotun sonu. </li><li> Bu boya enjeksiyonu kolaylaştırır ve çoklu membran girmeler tarafından yapılan hasar azaltır gibi, konik elektrotlar için faydalıdır. Biz bir tuzlu su / alümina toz süspansiyonu bir akım üretir özel beveler kullanın. Elektrot tutucu monte ve ucunun 45 ° açıyla akışı girer. Direnci KAC dolu elektrotlar için yaklaşık 5 MOhm ulaştığında Elektrod direnci sürekli olarak izlenmekte ve bizote sonlandırılır. Boya dolu elektrotlar bir zaman eşit miktarda eğimli ve genellikle 15-20 MOhm arasında dirençleri vardır. </li></ol> 3. Kalsiyum Gösterge Boya yükleniyor <ol><li> Bir elektrofizyoloji teçhizat hazırlık yerleştirin ve görsel ilgi presinaptik nöron bulun. Bizim deneylerin çoğu beslenme, B21 5, 6 sırasında yararlanılan belirlenen duyusal nöron ile yapılır. Nispeten sabit position, boyut (~ 100 mikron) ve B21 en soma uzatılmış şekli bulmak için kolaylaştırır. </li><li> Kalsiyum gösterge boyası içeren bir elektrot ile ilgi nöron kazığa oturtmak. B21 kimlik post-sinaptik nöron B8 impaling ile kontrol edilebilir. ~ 8 nA akımı ile B21 arasında depolarizasyon sivri ve B8 7 PSP kolaylaştırmada sonucu tetikleyecektir. </li><li> Yaklaşık olarak 30 dakika için hiperpolarize darbeleri (tipik olarak, -15 nA, 1 Hz,% 75 görev döngüsü) geçme ile, ilgilenilen presinaptik nöronların içinde boya enjekte edilir. Boya yükleme başarılı olursa, nöronun soma soluk pembe renk kazanacaklardır. Yavaş nöron onu çekerek boya içeren elektrot çıkarın. </li><li> Boya takipçisi nöronlar ile sinaptik temas ince süreçlere yayılması için yaklaşık 30 dakika hazırlıkları bırakın. </li></ol> 4. Kalsiyum Görüntüleme ve elektrofizyolojik Kaydı <ol><li> Görüntüleme Microsc üzerinde hazırlık yerleştirinope. Hazırlık ile çanak kil aksine, ıslakken yapışkan kalır Permagum sızdırmazlık kord parçaları ile bir soğutma platformu üzerinde tutulur. Sabit mikroskobu objektif hareket ettirerek odaklanır. Sahne mıknatıs monte manipülatörler bağlama izin veren, sabit kalır. Yüksek büyütme titreşimleri (özellikle yanal hareket) bir sorun yapar gibi, tüm görüntüleme kurulumu bir titreşim izolasyonu platform üzerine konulmalıdır. </li><li> Normal elektrolit solüsyonu içeren elektrotlar ile presinaptik ve postsinaptik nöronlarda kazığa oturtmak. </li><li> Görüntü Kalsiyum Turuncu uygun bir filtre bloğu (eksitasyon 549 nm, emisyon 576 nm) 8 seçin ve kamerayı ayarlayın. Çoğu bilimsel CCD kameralar araştırıcı dışarı okunan CCD hücrelerinin bir alt kümesi seçmek için izin. Ek olarak, hücreler (binned) kombine edilebilir. Ederken binning duyarlılığı artırır, daha küçük bir alt kümesini artar hız seçme. Bu iki ayar birlikte pozlama süresi ile belirlemekKare hızı saniyede elde edilebilir kaç resim yani. Uygun ayarları olacak görüntüyü 500 x 300 piksel (10x lens ve 0.5x kamera adaptörü kullanarak) ile 580 x 350 mikron 2 bir alan. Bir maruziyet süresi &lt;25 ms ile doğru pozlama sağlar az miktarda aydınlatma yoğunluğunu ayarlamak için ışık yolu ile nötral yoğunluk filtreleri ekleyin. Bu ayarlar yaklaşık 30 Hz kare hızı yol açmalıdır - Aplysia&#39;nın kalsiyum değişiklikler uyarılmış görüntüyü tek başak için yeterince hızlı olan. Son olarak, sadece görüntülü alan aydınlatılır, böylece alan açıklık bulunur. </li><li> Görüntüleme yazılımı olarak ölçmek istediğiniz nöronun bölgeleri işaretlemek. Elements AR yazılımı bu ilgi alanları (ROI) yerleştirilerek &quot;Zaman Ölçümü&quot; bölümünde yapılır. B21 Bir bipolar nöron ve daha önceki çalışmaları ilgi 9 onun lateral çıkıntısı kişileri postsinaptik nöron göstermiştir. Biz genellikle görüntü birincil, ikincil ve üçüncül sutyennöron her bir parçası üzerinde bir ROI yerleştirerek yanal işlemi nches. Boya dolu nöron için yanındaki bir başka ROI daha sonra, diğer tüm veri noktaları çıkartılır bir arka plan değeri sağlamak için ölçülür. </li><li> Kameranın &quot;çerçeve okuma&quot; sinyali tarafından sağlanan bir tetikleme sinyali beklemek elektrofizyoloji iktisabı (bu deneylerde Spike II) söyleyin. Görüntü elde etme (Elements AR) başlatın; kameranın ilk karesini alır zaman Spike II şimdi otomatik olarak kayda başlayacaktır. Ayrıca kısaca mikroskop kamera bağlantı noktasına monte edilmiş bir LED yanar 1401 Güç bir TTL çıkışını kullanabilirsiniz. Bu sonradan görüntüleme ve elektrofizyolojik verileri senkronize etmek için bir sinyal verecektir. </li><li> Istenilen frekansta kısa depolarize akım darbeleri arasında bir dizi enjekte presinaptik nöronların teşvik. Bu bir aksiyon potansiyeli successf olup olmadığını belirlemek için (bir uyarıcı tetiklenen osiloskop gibi) her bir darbe izlemek için önemlidirUlly oluşturulur. Kalsiyum Turuncu diğer boyalara göre çok foto stabil iken, meydana beyazlatma boya ne kadar kontrol etmek uyarımı olmaksızın bir kontrol deneme kaydetmek iyi bir fikirdir. </li><li> Hücre içi kalsiyum konsantrasyonları manipüle edildiği denemelerde, EGTA gibi bir ilaç presinaptik sinir hücresi içine uygulanır ve yukarıda tarif edilen uyar ve veri toplama işlemler tekrarlanır. </li></ol> 5. Örnek Veri Analizi <ol><li> Bir metin dosyasına yazarak görüntüleme verileri (her bir ROI için ölçülen yoğunluk değerleri listesi) aktarın. Spike II özel bir komut dosyası daha sonra metin dosyasını içe aktarabilirsiniz. Bu program, bireysel sondanın alanı değerlerini normalleştirir ve arka plan prob değerini çıkarır. Veri noktaları daha sonra bir &quot;sanal RealWave&quot; kanal olarak elektrofizyoloji verilerle birlikte çizilir. Spike II &quot;kanal prosesi / zaman kaydırma fonksiyonu&quot; hassas görüntüleme verileri poi hizalamak için kullanılırreferans olarak LED sinyal kullanarak NTS,. </li><li> Yüzde değişim gibi değerleri elde etmek için, dF olarak floresans içinde göreceli değişiklik hesaplayarak görüntüleme verileri analiz / F o = (FF o) / F o. F o sadece uyaran sırasında uyarıcı ve F floresans önce floresans seviyesini gösterir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Deney Genel düzeni. Deneyler Aplysia bir ganglion hazırlık yapılır. Hücre içi kalsiyum değişim iontophoretically presinaptik nöronların sokulur bir floresan boya olan görüntülü. Bu sinaptik iletim indüklenen ve izlenebilir böylece Pre-ve postsinaptik nöronlarda sonra keskin elektrotlar ile Impaled edilir. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> <strong&gt; Şekil 2. Kalsiyum görüntüleme ve Aplysia&#39;nın ve bukkal ganglion tespit nöronların hücre içi kayıt. Nöron B21 ve görüntülü yan dal (A) Foto. Kutu ilgi ölçülen bölgesi gösterir. B21 ve (B1) Hücre içi stimülasyon aynı zamanda aksiyon potansiyelleri ateşe neden postsinaptik takipçisi nöron B8 (orta iz) aksiyon potansiyelleri (altta iz) ve kolaylaştırıcı postsinaptik potansiyelleri (PSP) çağrıştırıyor. Presinaptik kalsiyum floresan artışlar üst iz gösterilmiştir. Homosynaptic kolaylaştırma presinaptik EGTA arasında (B2) Etkisi. EGTA intraselüler olarak ~ 15 dakika daha önce hücre içi uyarım B21 içine enjekte edildi. Bu EGTA düşük konsantrasyonlarda sinaptik iletim bastırmak için yeterince hızlı değil yavaş hareket eden kalsiyum şelasyon olduğu düşünülmektedir. Yaygın kalsiyum sinyal ve PSP genlik karşılık gelen azalma azalma not edin. (C) PSP genlik presinaptik calciu ile ilişkilidirm sinyal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu aynı anda hücre için kalsiyum konsantrasyonunun izlemek ve sinaptik etkinliğinin değerlendirilmesi için de kullanılabilir yöntemleri göstermektedir. Bu teknikler, kısa süreli plastiklik çeşitli şekillerde nasıl yönlendirildiğini belirlenmesi bakımından yararlıdır. Görüntüleme floresan mikroskop ve CCD kamera ile yürütülmektedir. En fonksiyonel görüntüleme set-up ile karşılaştırıldığında bu ekipman gereksinimleri nispeten mütevazı. Tekniği basit ve ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlamak </td></tr><tr><td> Kalsiyum Turuncu </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum kalibrasyon tampon kiti </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> sinyalinin duyarlılık ve dinamik aralığı test etmek için yararlı </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür hekzahidrat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> hayvan anestetize 0.33 M solüsyon olarak kullanılmaktadır </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler kullanılır. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Yorumlamak </td></tr><tr><td> FN-1 dik floresan mikroskop </td><td> Nikon Instruments </td><td> Narishige ile ITS-FN1 aşamasında </td></tr><tr><td> NMN-21 manipülatörler </td><td> Narishige </td><td> mıknatıslar ile sahne üzerine monte </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD kamera </td><td> Fotometrik </td><td></td></tr><tr><td> NIS elemanları AR (Sürüm 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> görüntüleme yazılımı floresans verileri toplamak için kullanılan </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Planı Fluor hedefi </td><td> Nikon Instruments </td><td> Bu suya daldırma objektifi 3,5 mm çok uzun bir çalışma mesafesi vardır </td></tr><tr><td> 120 PC metal halide lamba X-Cite </td><td> EXFO </td><td> floresan görüntüleme için kullanılır </td></tr><tr><td> LS-DWL halojen lâmba </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-Cy3 filtre seti </td><td> Chroma Teknoloji </td><td>; </td></tr><tr><td> Güç 1401 A / D dönüştürücü </td><td> Cambridge Elektronik Tasarım </td><td> örnekleme 3 kHz&#39;de yapıldı </td></tr><tr><td> Spike II (Sürüm 7.07) </td><td> Cambridge Elektronik Tasarım </td><td> Yazılım elektrofizyoloji verileri toplamak için kullanılan </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplifikatör </td><td> NPI elektroniği </td><td> 10X bir headstage ile ikinci </td></tr><tr><td> Model 410 amplifikatör </td><td> Brownlee hassas </td><td> sinyali yükseltmek ve filtrelemek için kullanılır </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> eksi k Teknolojisi </td><td> görüntüleme için titreşim izolasyonu </td></tr><tr><td> soğutma platformu </td><td> ısmarlama </td><td> pirinç levha hangi aracılığıyla buz su bir değişken hızında pompalanan </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Kullanılan ekipman.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Bu, hücre içi kalsiyumda değişiklikler sinaptik plastisite (örn., homosynaptic kolaylaştırma 1) arasında önemli formları bir dizi indüksiyon aracılık öne sürülmüştür. Bu hipotezler eşzamanlı intraselüler kalsiyum değişiklikleri ve sinaptik etkinliği değişiklikler izlenerek test edilebilir. Bu hücre içi kayıt tekniği ile kalsiyum görüntüleme birleştirerek gerçekleştirilebilir gösterilmektedir. Bizim deneyler yumuşakça Aplysia&#39;nın californica bir bukkal ganglion yapılmaktadır. Bu hazırlık deneysel avantajlı bir dizi özellik vardır: Gangliyon kolayca Aplysia&#39;nın kaldırılır ve deneyler, normal sinaptik bağlantıları yapmak ve normal bir iyon kanal dağıtım olan yetişkin nöron kullanmak olabilir. Aplysia için doğal hayvan düşük metabolik oranı ve nispeten düşük sıcaklıklarda (14-16 ° C) bağlı olarak, müstahzarlar uzun süreler boyunca stabildir. Bu uzun dalga boyu floresan boya kalsiyum bağlandığı zaman biz kolayca iyontoforez yoluyla nöron içine &#39;yüklü&#39; olduğunu Kalsiyum Turuncu 2 hücre geçirgenliği olmayan sürümünü kullanacaktır intrasellüler serbest kalsiyum değişiklikleri. saptamak için ent &quot;&gt;, floresan yoğunluğu artar. Kalsiyum Turuncu var hızlı kinetik özellikleri 3 ve rasyometrik boyalar aksine (örneğin, Fura 2), görüntüleme için herhangi bir filtre tekerleği gerektirir. Kararlı ve diğer boyalar (örneğin, flüoresan 3) 2,4 daha az fototoksik oldukça fotoğrafı. olmayan tüm rasyometrik gibi Bu yükleme ve difüzyon nedeniyle boya konsantrasyon değişiklikleri hesaba katmak için mümkün değildir, çünkü boyalar, kalsiyum Orange, kalsiyum konsantrasyonu olarak göreceli değişiklikleri gösterir. Ancak, bu mutlak bir kalsiyum konsantrasyonu sağlayacak şekilde kalibre edilebilir değildir. Bir dik, sabit sahne, bileşik mikroskop saniyede 30 kare etrafında kayıt yapabilen bir CCD kamera ile görüntü nöronlar için kullanılmıştır. Aplysia&#39;nın Bu zamansal çözünürlükteHücre içi kalsiyum konsantrasyonunda dahi, tek bir sivri uç oluşturulan değişiklik tespit etmek için yeterli olacaktır. Keskin elektrotlar aynı anda tespit pre-ve postsinaptik nöronların sinaptik indüklemek ve kaydetmek için kullanılır. Her denemenin sonunda, özel bir komut dosyası elektrofizyoloji ve görüntüleme verileri birleştirir. Doğru senkronizasyon sağlamak için biz mikroskop kamera bağlantı noktasına monte edilmiş bir LED bir ışık nabız kullanın. Presinaptik kalsiyum düzeyleri (intrasellüler EGTA enjeksiyon yoluyla örneğin) Manipülasyonu bize plastisite çeşitli şekillerde arabuluculuk intraselüler kalsiyum rolüne ilişkin spesifik hipotezleri test etmeye imkan vermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini göstermektedir<em&gt; Aplysia&#39;nın</em&gt;. Biz görüntü intraselüler kalsiyum floresan boya, Kalsiyum Turuncu ve keskin (hücre içi) elektrotlar ile sinaptik iletim teşvik ve izlemek kullanarak.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K Görüntüleme.  Mt. Sinai School of Medicine. Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini göstermektedir Aplysia'nın. Biz görüntü intraselüler kalsiyum floresan boya, Kalsiyum Turuncu ve keskin (hücre içi) elektrotlar ile sinaptik iletim teşvik ve izlemek kullanarak.

Video: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Nörobilim

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.