A PHS Grant (MH51393) unterstützt diese Arbeit. Einige der Aplysia wir werden von den nationalen Ressource für Aplysia der University of Miami unter Grant RR10294 vom National Center for Research Resources, NIH zur Verfügung gestellt.

Ein. Vorbereitung <ol><li> Das Tier zu betäuben durch Einspritzen 75-100 ml isotonischer Magnesiumchloridlösung. Die Aplysia verwenden wir für die Bildgebung sind in der Regel 150-200 Gramm und werden von Marinus Scientific erhalten. </li><li> Merken die narkotisierten Tier zu einem Wachs bedeckt Gericht. Spritzennadeln funktionieren gut für diesen Zweck, sterile Techniken sind nicht erforderlich. Mit grober Pinzette und Standard-Schere einen Einschnitt in das Tier den Fuß und setzen die bukkalen Masse. Suchen Sie die bukkale Ganglion. Mit Feder Schere und feinen Pinzette vorsichtig kostenlos das Ganglion, indem alle bukkalen Nerven. </li><li> Entfernen Sie das Ganglion und legen Sie sie in einem Sylgard beschichtete Schale mit künstlichem Meerwasser. Legen Sie ein paar Insekten Stifte durch die bukkalen Nerven das Ganglion stabilisieren. Desheath die bukkale Ganglion mit ultrafeinen Pinzette und Schere Feder, um so die Neuronen für intrazelluläre Aufnahme freizulegen. Dann wieder Pin das Ganglion mit etwa 15 fein Insekt (minutien) Pins. Das Ganglion müssen fest an ihrem Platz gehalten werden, da jede Bewegung wird während der Bildgebung problematisch. </li></ol> 2. Bereiten Elektroden <ol><li> Ziehen Sie Elektroden mit Glas Kapillarrohr mit Filament (zB WPI TW100F-4) und einen Abzieher. Einstellungen sollte individuell festgelegt werden, um Elektroden der erforderlichen Widerstand zu erzeugen. Wenn mit 3 M KAc gefüllt (Kaliumacetat) unserer Elektrodenwiderstand beträgt im allgemeinen etwa 10 MOhm, wenn die Elektroden zu abgeschrägt werden, oder etwa 5 MOhm wenn die Abschrägung Schritt ausgelassen sind. </li><li> Füllen eines Satzes von Elektroden mit einer Lösung, die 3 M KAc/30 mM KCl mit einer Spritze und Nadel Mikrofilters. Diese Elektroden werden für die Elektrophysiologie verwendet werden. </li><li> Füllen eines zweiten Satzes von Elektroden mit dem Calcium-Indikator-Farbstoff durch Eintauchen des hinteren Endes der Elektrode in Farbstoff zuvor rekonstituiert mit ca. 40 ul destilliertes Wasser für 500 &amp;mgr; g Farbstoff. Wenn die Spitze der Elektrode gefüllt ist, zurück zu füllen etwa 1/4 Zolldes Endes der Elektrode mit 200 mM KCl um einen guten elektrischen Kontakt zu gewährleisten. </li><li> Es ist vorteilhaft, die Elektroden Fase, wie dies erleichtert Farbstoffinjektion und reduziert die Beschädigung durch mehrfache Durchdringungen Membran durchgeführt. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Beveler die einen Strom von eine Salzwasser / Aluminiumoxidpulver Suspension erzeugt. Die Elektrode wird in einer Halterung montiert ist und ihre Spitze tritt in den Strom an einer 45 °-Winkel. Elektrodenwiderstand wird kontinuierlich überwacht und die Abschrägung beendet, wenn der Widerstand erreicht etwa 5 MOhm für KAc gefüllten Elektroden. Die Farbstoff gefüllten Elektroden für eine gleiche Zeitdauer abgeschrägt und haben typischerweise Widerstände von 15-20 MOhm. </li></ol> 3. Laden des Calcium-Indikatorfarbstoff <ol><li> Legen Sie die auf der Grundlage einer Elektrophysiologie rig und visuell suchen Sie die präsynaptischen Neuron von Interesse. Viele unserer Experimente sind mit einem identifizierten sensorischen Neuronen während der Fütterung, B21 5, 6 genutzt getan. Die relativ fest position, Größe (~ 100 um) und längliche Form der B21 die soma machen es leicht zu finden. </li><li> Aufzuspießen das Neuron von Interesse mit einer Elektrode mit dem Calcium-Indikator-Farbstoff. B21 kann die Identität durch Aufspießen der postsynaptischen Neuron B8 überprüft werden. Depolarisation B21 mit ~ 8 nA Strom auslösen Spikes und Ergebnis bei der Erleichterung PSPs in B8 7. </li><li> Inject Farbstoff in der präsynaptischen Neuron von Interesse, indem hyperpolarisierenden Impulse (typischerweise -15 nA, 1 Hz, 75% ED) für etwa 30 Minuten. Wenn Farbstoffbeladung erfolgreich ist, wird des Neurons Soma Erwerb eine schwache rosa Farbe. Entfernen der farbstoffhaltigen Elektrode durch langsames Herausziehen aus dem Neuron. </li><li> Hinterlegen Zubereitungen für etwa 30 Minuten, damit der Farbstoff in die feinen Prozesse synaptischen Kontakt herzustellen mit Folger Neuronen diffundieren. </li></ol> 4. Calcium Imaging und elektrophysiologische Recording <ol><li> Legen Sie die Vorbereitung auf die Bildgebung MicroscOPE. Die Schale mit der Vorbereitung auf einem Kühltisch mit Stücken von Permagum Dichtschnur, die im Gegensatz Ton, bleibt klebrig, wenn feucht gehalten werden. Die feste Stage-Mikroskop konzentriert, indem das Ziel. Die Bühne bleibt stationär, welche ermöglicht Befestigung angebrachten Magneten Manipulatoren. Da die hohe Vergrößerung macht Vibrationen (insbesondere seitliche Bewegung) ein Problem, sollte die gesamte bildgebende Einrichtung auf einer Schwingungsisolierung Plattform platziert werden. </li><li> Aufspießen präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen mit Elektroden, die normale Elektrolyt-Lösung. </li><li> Wählen Sie einen Filter Block geeignet Bild Calcium Orange (Anregung 549 nm, Emission 576 nm) 8 und stellen Sie die Kamera. Wissenschaftlichste CCD-Kameras kann der Untersucher eine Teilmenge der CCD-Zellen, die ausgelesen werden wählen. Darüber hinaus können die Zellen kombiniert (klassierten) werden. Auswählen einer kleineren Teilmenge erhöht die Geschwindigkeit, während Binning erhöht die Empfindlichkeit. Diese beiden Einstellungen, zusammen mit der Belichtungszeit, zu bestimmendie Frame-Rate, dh wie viele Bilder Sie pro Sekunde erfasst werden. Geeignete Einstellungen wird Bild eine Fläche von 580 x 350 um 2 mit 500 x 300 Pixel (mit einem 10x-Objektiv und einem 0,5-Kamera-Adapter). Fügen Neutralfilter zum Lichtweg, um die Beleuchtungsstärke auf die minimale Menge, die korrekte Belichtung mit einer Belichtungszeit &lt;25 ms bietet einzustellen. Diese Einstellungen sollten in einer Bildrate von ca. 30 Hz führen - was in Aplysia ist schnell genug, um Bild single spike evozierte Calcium Veränderungen. Schließlich schließen Feldblende so dass nur der abgebildeten Fläche beleuchtet wird. </li><li> In der Imaging-Software markieren des Neurons Regionen, die Sie messen möchten. Im Elements AR-Software wird dies in der &quot;Time Measurement&quot; Abschnitt, indem Regions of Interest (ROI) durchgeführt. B21 ein bipolarer Neuron und frühere Arbeiten haben gezeigt, dass ihre seitliche Prozess kontaktiert den postsynaptischen Neuron von Interesse 9. Wir in der Regel Bild primären, sekundären und tertiären branches des seitlichen Verfahrens, indem ein ROI über jeden Teil des Neurons. Eine zusätzliche ROI neben dem Farbstoff gefüllt Neuron wird gemessen, um einen Hintergrund-Wert, der von allen anderen später Datenpunkten subtrahiert wird bereitzustellen. </li><li> Weisen Sie den Elektrophysiologie Akquisition (in diesen Experimenten Spike II) für ein Trigger-Signal von der &quot;frame Auslese&quot;-Signal der Kamera vorgesehen warten. Starten Sie die Bildaufnahme (Elements AR); Spike II wird nun startet die Aufnahme automatisch, wenn die Kamera nimmt seinen ersten Frame. Sie können auch ein TTL-Ausgang des Power 1401, kurz auf eine LED in der Mikroskop-Kamera-Anschluss montiert einzuschalten. Dies wird ein Signal, um anschließend zu synchronisieren bildgebende und elektrophysiologische Daten. </li><li> Stimulieren das präsynaptische Neuron durch Injizieren einer Reihe von kurzen Stromimpulsen depolarisierende bei der gewünschten Frequenz. Es ist wichtig, jeden Impuls zu überwachen (z. B. mit einem Reiz ausgelöst Oszilloskop), um zu bestimmen, ob ein Aktionspotential successf istully erzeugt. Während Calcium Orange ist sehr photo-stabil im Vergleich zu anderen Farben, ist es eine gute Idee, eine kontrollierte Studie ohne Stimulation aufnehmen, um zu überprüfen, wie viel Farbbleichung auftritt. </li><li> In Experimenten, in denen intrazelluläre Kalziumkonzentration manipuliert wird ein Arzneimittel, wie EGTA in das präsynaptische Neuron eingeführt und die Stimulation und Datenerfassung oben beschriebenen Schritte werden wiederholt. </li></ol> 5. Analyse von repräsentativen Daten <ol><li> Exportieren Sie die Bilddaten (die Liste der gemessenen Intensitätswerte für jede ROI), indem Sie ihn in eine Textdatei. Ein benutzerdefiniertes Skript in Spike II kann dann importieren Sie die Textdatei. Dieses Skript normalisiert auch die Werte mit den einzelnen Sonde Bereich, und subtrahiert den Wert des Hintergrunds Sonde. Die Datenpunkte werden dann neben den elektrophysiologischen Daten als &quot;virtuelle RealWave&quot; Kanal aufgetragen. Der &quot;Kanal Prozess / Timeshift-Funktion&quot; in Spike II wird verwendet, um genau ausrichten Bilddaten points, ​​mit dem LED-Signal als Referenz. </li><li> Um Werte als prozentuale Veränderung zu erhalten, analysiert die Bilddaten durch Berechnung der relativen Änderung in der Fluoreszenz als dF / F o = (FF o) / F o. F o die Fluoreszenzpegel kurz vor der Stimulus und F die Fluoreszenz während der Stimulus. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Die Experimente werden in einem Ganglion Vorbereitung der Aplysia durchgeführt. Veränderungen der intrazellulären Calcium werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der iontophoretisch in das präsynaptische Neuron eingeführt wird abgebildet. Prä-und postsynaptischen Neuronen werden dann mit scharfen Elektroden aufgespießt, so dass die synaptische Übertragung kann induziert und überwacht werden. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> <strong&gt; Abbildung 2. Calcium imaging und intrazelluläre Aufnahme von identifizierten Neuronen in der bukkalen Ganglion Aplysia. (A) Foto des abgebildeten Seitenarm des Neurons B21. Die Box gibt den gemessenen Bereich von Interesse. (B1) Intrazelluläre Stimulation der B21 erinnert Aktionspotentiale (untere Kurve) und die Erleichterung postsynaptischen Potentiale (PSPs) in der postsynaptischen Follower Neuron B8 (mittlere Spur), was es auch Feuer Aktionspotentiale. Erhöhungen der präsynaptischen Calcium Fluoreszenz sind in der oberen Kurve dargestellt. (B2) Effekt der präsynaptischen EGTA auf homosynaptische Erleichterung. EGTA wurde intrazellulär in B21 ~ 15 Minuten vor intrazelluläre Stimulation injiziert. Es wird vermutet, dass EGTA ein langsam wirkendes Calciumchelator, die bei niedrigen Konzentrationen ist nicht schnell genug auf die synaptische Transmission zu unterdrücken. Beachten Sie die Reduzierung der weit verbreiteten Kalzium-Signal und die entsprechende Abnahme der PSP Amplitude. (C) Die PSP Amplitude korreliert mit der präsynaptischen Calcium Signal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir demonstrieren Techniken, die verwendet werden, um gleichzeitig zu überwachen die intrazelluläre Calciumkonzentration und Beurteilung der Wirksamkeit der synaptischen Übertragung kann. Diese Techniken sind nützlich, um zu bestimmen, wie verschiedene Formen von kurzfristigen Plastizität vermittelt werden. Das Abbildungssystem wird mit einem Fluoreszenzmikroskop und CCD-Kamera durchgeführt wird. Diese Anforderungen an die Ausrüstung sind relativ bescheiden, wenn die meisten der funkt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Calcium orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium Kalibrierpuffer Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> zum Testen der Empfindlichkeit und den Dynamikbereich des Signals </td></tr><tr><td> Magnesiumchloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> verwendet in 0,33 M Lösung Tier zu betäuben </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung Name </td><td> Firma </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> FN-1 aufrecht Fluoreszenzmikroskop </td><td> Nikon Instruments </td><td> mit Narishige ITS-FN1 Bühne </td></tr><tr><td> NMN-21 Manipulatoren </td><td> Narishige </td><td> montiert auf der Bühne mit Magneten </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2-CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elementen AR (Version 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> Imaging-Software verwendet werden, um Fluoreszenz-Daten zu erfassen </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor Ziel </td><td> Nikon Instruments </td><td> Dieses Wasser Immersionslinse hat einen sehr langen Arbeitstag Abstand von 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 PC Metallhalogenidlampe </td><td> EXFO </td><td> verwendet für die Fluoreszenz-Bildgebung </td></tr><tr><td> LS-DWL Halogenlampe </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 Filter-Set </td><td> Chroma Technology </td><td>; </td></tr><tr><td> Macht 1401 A / D-Wandler </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Probenahme wurde bei 3 kHz getan </td></tr><tr><td> Spike II (Version 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Software zur Elektrophysiologie Daten erfassen </td></tr><tr><td> SEC-10 LX-Verstärker </td><td> NPI-Elektronik </td><td> verwendet mit einem 10X Headstage </td></tr><tr><td> Modell 410 Verstärker </td><td> Brownlee Präzision </td><td> zum Verstärken und Filtern des Signals </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> minus k Technologie </td><td> Schwingungsisolierung für die Bildgebung </td></tr><tr><td> Kühltisch </td><td> Maßarbeit </td><td> Messingplatte durch welche Eiswasser mit einer variablen Rate gepumpt </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung verwendet.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Es wurde vorgeschlagen, dass Änderungen in intrazellulärem Calcium die Induktion einer Reihe von wichtigen Formen der synaptischen Plastizität (zB homosynaptische Erleichterung) 1 vermitteln. Diese Hypothesen lassen sich durch gleichzeitiges Überwachen von Änderungen der intrazellulären Calcium-und Umbauten in der synaptischen Wirksamkeit getestet werden. Wir zeigen, wie dies durch die Kombination von Calcium-Imaging mit intrazellulären Aufnahme Techniken erreicht werden kann. Unsere Experimente sind in einer bukkalen Ganglienzellen der Mollusken Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat hat eine Reihe von vorteilhaften Merkmalen experimentell: Ganglia leicht aus Aplysia entfernt werden und Experimente verwendet adulten Neuronen, die normale synaptische Verbindungen herzustellen und haben eine normale Ionenkanal Verteilung. Aufgrund der niedrigen Stoffwechsel des Tieres und den relativ niedrigen Temperaturen (14-16 ° C), die natürlich für Aplysia sind, sind die Vorbereitungen für längere Zeit stabil. ent &quot;&gt; Um Änderungen in der intrazellulären freien Calcium wir die Zelle impermeante Version von Calcium Orange 2, die leicht &#39;geladen&#39; in einem Neuron über Iontophorese ist verwenden. erkennen Wenn diese langwellige Fluoreszenz-Farbstoff bindet an Kalzium, Fluoreszenzintensität steigt. Calcium Orange hat schnelle kinetische Eigenschaften 3 und im Gegensatz ratiometrische Farbstoffe (beispielsweise Fura 2), erfordert keine Filterrad zur Bildgebung. Es ist ziemlich stabil und weniger Foto phototoxische als andere Farbstoffe (zB Fluo-3) 2,4. Wie alle nicht-ratiometrische Farbstoffe, Calcium orange relativen Änderungen der Kalziumkonzentration anzeigt. Aber weil es nicht möglich ist, um Veränderungen in Farbstoffkonzentration durch Belastung und Diffusion, kann es nicht zur absoluten kalibrierten Calciumkonzentrationen bereitzustellen. Ein aufrechter, feste Phase, zusammengesetzten Mikroskop wurde Bildes Neuronen mit einer CCD-Kamera in der Lage ist die Aufnahme etwa 30 Bildern pro Sekunde verwendet. In Aplysia diese zeitliche Auflösungist mehr als ausreichend, um auch nur einen einzigen Dorn induzierte Veränderung der intrazellulären Calcium-Konzentration zu detektieren. Sharp Elektroden gleichzeitig verwendet zu induzieren und aufzuzeichnen synaptischen Übertragung in identifizierten prä-und postsynaptischen Neuronen. Am Ende eines jeden Prozesses vereint ein benutzerdefiniertes Skript Elektrophysiologie und Bildgebung Daten. Um eine korrekte Synchronisation zu gewährleisten verwenden wir einen Lichtimpuls aus einer LED in den Kamera-Anschluss des Mikroskops montiert. Manipulation von präsynaptischen Kalziumspiegel (zB über intrazelluläre EGTA Injektion) ermöglicht es uns, spezifische Hypothesen über die Rolle der intrazellulären Calcium bei der Vermittlung verschiedener Formen von Plastizität zu testen.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden<em&gt; Aplysia</em&gt;. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K Aufrufe.  Mt. Sinai School of Medicine. Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden Aplysia. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.

Serie: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Biotechnik

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Biologie

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel

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