Una borsa di studio PHS (MH51393) ha sostenuto questo lavoro. Alcuni dei Aplysia usiamo sono fornite dal Risorse Nazionale per l&#39;Aplysia dell&#39;Università di Miami sotto Grant RR10294 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, NIH.

1. Preparazione <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale mediante iniezione di 75-100 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio. L&#39;Aplysia che usiamo per l&#39;imaging sono in genere 150-200 grammi e sono ottenuti da Marinus scientifico. </li><li> Pin anestetizzato l&#39;animale a un piatto coperto di cera. Aghi per siringhe funzionano bene per questo scopo; tecniche sterili non sono necessari. Utilizzo di pinze e forbici lordi standard, fare un&#39;incisione nel piede dell&#39;animale ed esporre la massa buccale. Individuare il ganglio vestibolare. Utilizzo di forbici e pinze a molla raffinati, cura gratuitamente il ganglio, tagliando tutti i nervi vestibolari. </li><li> Rimuovere il ganglio e metterlo in un piatto rivestito Sylgard contenente acqua di mare artificiale. Mettere un paio di perni di insetti attraverso i nervi buccale per stabilizzare il ganglio. Desheath il ganglio vestibolare con pinze e forbici ultrafini primavera, in modo da esporre i neuroni per la registrazione intracellulare. Poi ri-pin del ganglio con circa 15 insetti fine (minutien) pin. Il ganglio deve essere tenuta saldamente in posizione come qualsiasi movimento sarà problematica durante l&#39;esposizione. </li></ol> 2. Preparare Elettrodi <ol><li> Tirare elettrodi con tubo capillare di vetro con filamento (ad esempio WPI TW100F-4) e di un estrattore. Le impostazioni dovrebbero essere determinato individualmente per creare elettrodi della necessaria resistenza. Quando riempito con 3 M Kac (acetato di potassio), la nostra resistenza elettrodo è generalmente di circa 10 MOhm se gli elettrodi devono essere smussati, o circa 5 MOhm se la fase di smussatura viene omesso. </li><li> Riempire una serie di elettrodi con una soluzione contenente 3 M KCl KAc/30 mM con una siringa e l&#39;ago Microfil. Questi elettrodi saranno utilizzati per elettrofisiologia. </li><li> Riempire una seconda serie di elettrodi con il colorante indicatore calcio immergendo l&#39;estremità posteriore dell&#39;elettrodo in tintura, precedentemente ricostituito con ca. 40 microlitri di acqua distillata per tintura 500μg. Quando la punta dell&#39;elettrodo è riempito, riempimento posteriore circa 1/4 pollicedella estremità dell&#39;elettrodo con 200 mM KCl per assicurare un buon contatto elettrico. </li><li> È vantaggioso per smussare gli elettrodi, ciò facilita l&#39;iniezione colorante e riduce il danno di membrana penetrazioni multiple. Usiamo un beveler personalizzato che genera un flusso di una sospensione di acqua salata / allumina polvere. L&#39;elettrodo è montato su un supporto e la sua punta entra nel flusso con un angolo di 45 °. Resistenza dell&#39;elettrodo viene continuamente monitorata e la smussatura terminato quando la resistenza raggiunge circa 5 MOhm per gli elettrodi KAC pieni. Gli elettrodi colorante piene sono smussati per un uguale periodo di tempo e in genere hanno resistenze di MOhm 15-20. </li></ol> 3. Caricamento del colorante indicatore di calcio <ol><li> Mettere il preparato su una piattaforma elettrofisiologia e individuare visivamente il neurone presinaptico di interesse. Molti dei nostri esperimenti sono fatti con un neurone identificato sensoriale utilizzata durante l&#39;alimentazione, B21 5, 6. La Positio relativamente fisson, dimensioni (~ 100 micron), e la forma allungata del soma B21 lo rendono facile da individuare. </li><li> Impalare il neurone di interesse con un elettrodo contenente il colorante indicatore di calcio. B21 identità può essere verificata impalandoli postsinaptica neurone B8. Depolarizzazione di B21 con ~ 8 corrente nA attiverà punte e risultati nel facilitare PSP in B8 7. </li><li> Iniettare colorante nel neurone presinaptico di interesse passando impulsi iperpolarizzante (tipicamente -15 nA, 1 Hz, duty cycle del 75%) per circa 30 minuti. Se il caricamento colorante è successo, soma del neurone acquisirà un colore rosa tenue. Rimuovere il colorante contenente elettrodo lentamente ritirando dal neurone. </li><li> Lascia i preparativi per circa 30 minuti per permettere al colorante di diffondersi nei processi sottili che fanno contatto sinaptico con i neuroni follower. </li></ol> 4. Calcio Imaging e registrazione elettrofisiologica <ol><li> Mettere il preparato sul microsc immaginiOpe. Il piatto con la preparazione si svolge su un tavolo di raffreddamento con pezzi di filo sigillante Permagum che, a differenza di argilla, rimane appiccicosa quando è bagnato. Il microscopio palcoscenico fisso concentra spostando l&#39;obiettivo. Lo stadio resta fermo, che permette di collegare manipolatori magnete montato. Come l&#39;ingrandimento elevato rende le vibrazioni (in particolare il movimento laterale) un problema, il programma di installazione di imaging intero deve essere posto su una piattaforma di isolamento dalle vibrazioni. </li><li> Impale neuroni presinaptici e postsinaptici con elettrodi contenenti normale soluzione elettrolitica. </li><li> Selezionare un blocco filtro adatto al calcio Arancione immagine (eccitazione 549 nm, emissione 576 nm) 8 e regolare la telecamera. La maggior parte scientifici telecamere CCD permettono al ricercatore di scegliere un sottoinsieme di cellule CCD che vengono lette. Inoltre, le cellule possono essere combinati (categorizzate). Selezionando un piccolo sottoinsieme velocità aumenta, mentre aumenta la sensibilità binning. Queste due impostazioni, insieme con il tempo di esposizione, determinanoil frame rate cioè quante immagini possono essere acquisite al secondo. Impostazioni adatte volontà immagine su una superficie di 580 x 350 micron 2 con 500 x 300 pixel (con una lente 10x e un adattatore per fotocamera 0.5x). Aggiungere filtri a densità neutra al percorso di luce per regolare l&#39;intensità di illuminazione per la quantità minima che fornisce esposizione corretta con un tempo di esposizione &lt;25 ms. Queste impostazioni dovrebbe portare a un frame rate di circa 30 Hz - che in Aplysia è abbastanza veloce per singola immagine evocata picco alterazioni di calcio. Infine, chiudere il diaframma di campo in modo che solo l&#39;area imaged è illuminato. </li><li> Nel software di imaging segnare regioni del neurone che si desidera misurare. Nella AR Elements questo viene fatto in &quot;Tempo di misura&quot; sezione mettendo regioni di interesse (ROI). B21 è un neurone bipolare e lavoro precedente ha dimostrato che i suoi contatti processo laterale del neurone postsinaptico di interesse 9. In genere l&#39;immagine primaria, reggiseno secondaria e terziarianches del processo laterale mettendo una ROI su ogni parte del neurone. Un ulteriore ROI vicino al neurone colorante riempito viene misurata per fornire un valore di sfondo che viene successivamente sottratto da tutti gli altri punti dati. </li><li> Istruire l&#39;acquisizione elettrofisiologia (in questi esperimenti Spike II) attendere un segnale di trigger fornito dal &quot;lettura frame&quot; del segnale della telecamera. Avviare l&#39;acquisizione delle immagini (elementi AR); Spike II ora avviare automaticamente la registrazione quando la fotocamera prende il primo fotogramma. È inoltre possibile utilizzare una uscita TTL del Potere 1401 a passare brevemente in un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. Ciò fornirà un segnale per sincronizzare successivamente imaging e dati elettrofisiologici. </li><li> Stimolare il neurone presinaptico iniettando una serie di brevi impulsi depolarizzanti corrente alla frequenza desiderata. È importante monitorare ogni impulso (ad esempio con un oscilloscopio stimolo attivato) per determinare se un potenziale di azione è successfully generato. Mentre Arancione calcio è molto foto-stabile rispetto ad altri coloranti, è una buona idea registrare un processo di controllo senza stimolazione per controllare la quantità di colorante sbiancamento si verifica. </li><li> In esperimenti in cui vengono manipolate concentrazioni di calcio intracellulare, un farmaco come EGTA viene introdotto nel neurone presinaptico e le fasi di acquisizione e stimolazione dati sopra descritte vengono ripetute. </li></ol> 5. Analisi dei dati rappresentativi <ol><li> Esportare i dati di imaging (l&#39;elenco dei valori di intensità misurati per ogni ROI) scrivendo in un file di testo. Uno script personalizzato in Spike II quindi possibile importare il file di testo. Questo script normalizza anche i valori della sonda con zona dell&#39;individuo, e sottrae il valore della sonda sfondo. I punti dati vengono poi tracciate a fianco i dati di elettrofisiologia come &quot;virtuale RealWave&quot; canale. Il &quot;canale di processo / funzione Time Shift&quot; di Spike II viene utilizzato per allineare con precisione l&#39;imaging dati pointi, utilizzando il led di segnalazione come riferimento. </li><li> Per ottenere valori come variazione percentuale, analizzare i dati di imaging calcolando la variazione relativa di fluorescenza come dF / F o = (FF o) / F o. F o denota il livello di fluorescenza appena prima dello stimolo e F la fluorescenza durante lo stimolo. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema generale della sperimentazione. Gli esperimenti sono condotti in un preparato ganglio di Aplysia. Variazioni di calcio intracellulare sono ripreso con un colorante fluorescente, che è iontophoretically introdotto nel neurone presinaptico. Neuroni pre-e post-sinaptico sono poi impalato con elettrodi appuntiti in modo che la trasmissione sinaptica può essere indotto e controllato. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. immagini di calcio e la registrazione intracellulare dai neuroni individuate nel ganglio vestibolare di Aplysia. (A) Foto del ramo laterale immaginata di neurone B21. Confezione indica la regione misurata di interesse. (B1) stimolazione intracellulare di B21 evoca potenziali d&#39;azione (linea di fondo) e favorire potenziali postsinaptici (PSP) nel neurone postsinaptico seguace B8 (metà traccia) facendolo sparare anche potenziali d&#39;azione. Aumenti nella fluorescenza di calcio presinaptico sono mostrati nella traccia superiore. (B2) Effetto della EGTA presinaptica di facilitazione homosynaptic. EGTA stato iniettato in intracellularmente B21 ~ 15 minuti prima della stimolazione intracellulare. Si pensa che EGTA è un chelante del calcio in qualità lento, che a basse concentrazioni non è abbastanza veloce per sopprimere la trasmissione sinaptica. Notare la riduzione del segnale di calcio diffusa e la corrispondente riduzione del PSP ampiezza. (C) L&#39;ampiezza PSP correla con la Calciu presinapticam segnale. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Dimostriamo tecniche che possono essere utilizzati per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e di valutare l&#39;efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche sono utili per determinare in che modo le varie forme di plasticità a breve termine sono mediati. L&#39;immagine viene eseguita con un microscopio a fluorescenza e camera CCD. Questi requisiti apparecchiature sono relativamente modesta se confrontata con la maggior parte di imaging funzionale ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Calcio Arancione </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio kit di calibrazione del buffer </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> utile per testare la sensibilità e la gamma dinamica del segnale </td></tr><tr><td> Magnesio cloruro esaidrato </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilizzato in soluzione 0,33 M di anestetizzare animale </td></tr></tbody></table> Reagenti Tabella 1. Usato. <table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature Nome </td><td> Azienda </td><td> Commento </td></tr><tr><td> FN-1 microscopio a fluorescenza in posizione verticale </td><td> Nikon Instruments </td><td> con Narishige ITS-FN1 stadio </td></tr><tr><td> NMN-21 manipolatori </td><td> Narishige </td><td> montato sul palco con i magneti </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD </td><td> Fotometrici </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementi AR (Versione 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> software di imaging utilizzato per acquisire dati di fluorescenza </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor obiettivo </td><td> Nikon Instruments </td><td> questa lente immersione ha una distanza molto lunga di 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lampada ad alogenuri metallici PC </td><td> EXFO </td><td> utilizzata per l&#39;imaging di fluorescenza </td></tr><tr><td> LS-DWL lampada alogena </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 filtro set </td><td> Tecnologia Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> Potenza 1401 A / D converter </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> il campionamento è stato fatto a 3 kHz </td></tr><tr><td> Spike II (Versione 7,07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Il software utilizzato per l&#39;acquisizione dei dati di elettrofisiologia </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificatore </td><td> NPI elettronica </td><td> utilizzato con un headstage 10X </td></tr><tr><td> Modello 410 amplificatore </td><td> Brownlee di precisione </td><td> utilizzato per amplificare e filtrare il segnale </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> meno k Tecnologia </td><td> isolamento dalle vibrazioni per l&#39;imaging </td></tr><tr><td> tavolo di raffreddamento </td><td> su misura </td><td> lastra di ottone attraverso cui l&#39;acqua viene pompata ghiaccio a tasso variabile </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Attrezzatura utilizzata.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

È stato suggerito che le variazioni di calcio intracellulare mediano l&#39;induzione di un certo numero di importanti forme di plasticità sinaptica (ad esempio, facilitazione homosynaptic) 1. Queste ipotesi possono essere testati contemporaneamente seguire l&#39;evoluzione del calcio intracellulare e alterazioni in termini di efficacia sinaptica. Si dimostra come questo può essere realizzato combinando calcium imaging con tecniche di registrazione intracellulari. I nostri esperimenti sono condotti in un ganglio vestibolare del mollusco Aplysia californica. Questa preparazione ha una serie di caratteristiche vantaggiose sperimentalmente: Ganglia può essere facilmente rimosso dal Aplysia ed esperimenti utilizzare neuroni adulti che rendono normali connessioni sinaptiche e hanno una distribuzione normale canale ionico. A causa del basso tasso metabolico dell&#39;animale e le temperature relativamente basse (14-16 ° C) che sono naturali per Aplysia, preparati sono stabili per lunghi periodi di tempo. ent &quot;&gt; Per rilevare le variazioni di calcio libero intracellulare useremo la versione impermeant cella di calcio Orange 2 che è facilmente &#39;caricato&#39; in un neurone tramite ionoforesi. Quando questo colorante fluorescente lunghezza d&#39;onda lunga si lega al calcio, aumenta l&#39;intensità di fluorescenza. calcio Orange ha veloci proprietà cinetiche 3 e, a differenza di coloranti raziometrici (ad esempio, Fura 2), non necessita di ruota portafiltri per l&#39;imaging. E &#39;abbastanza stabile e meno foto fototossiche di altri coloranti (ad esempio, fluo-3) 2,4. Come tutti i non-raziometrico coloranti, calcio Arancione indica variazioni relative di concentrazione di calcio. Ma, poiché non è possibile tener conto delle variazioni concentrazione di colorante dovute al carico e diffusione, non può essere calibrato per fornire concentrazioni di calcio assoluti. Un montante, fisso stadio, microscopio composto è stato usato per i neuroni di immagine con una fotocamera CCD in grado di registrare circa 30 fotogrammi al secondo. In questo Aplysia risoluzione temporaleè più che sufficiente per rilevare anche un singolo picco alterazione indotta nella concentrazione di calcio intracellulare. Elettrodi Sharp sono contemporaneamente utilizzati per indurre e registrare la trasmissione sinaptica in neuroni identificati pre-e post-sinaptico. Al termine di ogni prova, uno script personalizzato combina elettrofisiologia e dati di imaging. Per garantire la corretta sincronizzazione usiamo un impulso di luce da un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. La manipolazione dei livelli di calcio presinaptici (ad esempio tramite iniezione intracellulare EGTA) ci permette di testare ipotesi specifiche, riguardanti il ​​ruolo del calcio intracellulare nel mediare le varie forme di plasticità.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio<em&gt; Aplysia</em&gt;. Abbiamo immagine calcio intracellulare utilizzando un colorante fluorescente, Orange calcio, e indurre e controllare la trasmissione sinaptica con taglienti (intracellulare) elettrodi.

I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K Views.  Mt. Sinai School of Medicine. Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio Aplysia. Abbiamo immagine calcio intracellulare utilizzando un colorante fluorescente, Orange calcio, e indurre e controllare la trasmissione sinaptica con taglienti (intracellulare) elettrodi.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

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Neuroscienze

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

Caricamento di un colorante di calcio in terminazioni di nervi della rana attraverso il ceppo del nervo: registrazione transitoria del calcio nella giunzione neuromuscolare della rana

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.