A PHS Grant (MH51393) apoiaram este trabalho. Alguns dos Aplysia usamos são fornecidas pelo Nacional de Recursos para Aplysia, da Universidade de Miami, Grant RR10294 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, NIH.

1. Preparação <ol><li> Anestesiar os animais por injecção de 75-100 ml de solução isotónica de cloreto de magnésio. O Aplysia usamos para imagiologia são geralmente 150-200 gramas e são obtidos a partir Marinus Scientific. </li><li> Pin o animal anestesiado para um prato coberto de cera. Agulhas de seringa funcionam bem para esta finalidade; técnicas estéreis não são necessárias. Utilizando uma pinça e tesouras brutas padrão fazer uma incisão no pé do animal e expor a massa bucal. Localizar o gânglio vestibular. Com uma tesoura de mola e pinça fina, cuidadosamente livre gânglio cortando todos os nervos vestibulares. </li><li> Remover o gânglio e colocá-lo em um prato de Sylgard revestido contendo água do mar artificial. Coloque pinos de insectos poucos através dos nervos bucais para estabilizar o gânglio. Desheath o gânglio vestibular utilizando fórceps e tesouras ultrafinas de mola, de modo a expor os neurónios para gravação intracelular. Em seguida, re-pin o gânglio utilizando cerca de 15 insetos bem (minutien) pinos. O gânglio deve ser mantido firmemente no lugar como qualquer movimento será problemático durante o exame. </li></ol> 2. Prepare Eletrodos <ol><li> Puxe eletrodos utilizando tubos de vidro com filamento capilar (por exemplo, WPI TW100F-4) e um puxador. Configurações devem ser individualmente determinados a criar eletrodos da resistência necessária. Quando cheio com 3 M KAc (acetato de potássio) a resistência de eléctrodo é geralmente cerca de 10 MOhms se os eléctrodos estão a ser chanfrada, ou a cerca de 5 MOhms, se o passo de chanfradura é omitido. </li><li> Encher um conjunto de eléctrodos com uma solução contendo 3 M KCl mM KAc/30 utilizando uma seringa e agulha Microfil. Estes eléctrodos será usado para electrofisiologia. </li><li> Encher um segundo conjunto de eléctrodos com o corante indicador de cálcio, por imersão da extremidade traseira do eléctrodo em corante, previamente reconstituído com aprox. 40 ul de água destilada para a tintura 500 ug. Quando a ponta do eléctrodo tem preenchido, de volta encher cerca de 1/4 de polegadada extremidade do eléctrodo com 200 mM de KCl para garantir um bom contacto eléctrico. </li><li> É benéfico para biselar os eléctrodos, pois isso facilita a injecção de corante e reduz os danos causados ​​pela penetração de membrana múltiplos. Usamos uma beveler personalizada que gera um fluxo de uma suspensão de pó de água salgada / alumina. O eléctrodo é montada num suporte e a ponta entra na corrente em um ângulo de 45 °. Resistência do eletrodo é continuamente monitorada ea chanfradura encerrado quando a resistência atinge cerca de 5 MOhm para eletrodos Kac preenchidos. Os eléctrodos são chanfradas cheios de corante para uma igual quantidade de tempo e, tipicamente, têm resistências de MOhm 15-20. </li></ol> 3. Carregando o corante indicador de cálcio <ol><li> Coloque a preparação em uma plataforma de eletrofisiologia e localizar visualmente o neurônio pré-sináptico de interesse. Muitas das nossas experiências são feitas com um neurónio sensorial identificado utilizada durante a alimentação, B21 5, 6. A positio relativamente fixan, tamanho (~ 100 mm), e de forma alongada soma B21 tornam-no fácil de localizar. </li><li> Empalar o neurónio de interesse com um eléctrodo que contém o corante indicador de cálcio. B21 identidade pode ser verificada por empalar o neurónio pós-sináptico B8. Despolarização da B21 com ~ atual nA 8 irá desencadear picos e resultar em facilitar PSPs em B8 7. </li><li> Injectar corante no neurónio pré-sináptico de interesse pela passagem impulsos hiperpolarizantes (tipicamente -15 nA, 1 Hz, ciclo de trabalho de 75%) durante cerca de 30 minutos. Se corante é bem sucedida, soma do neurônio vai adquirir uma cor rosada. Remover o eléctrodo de corante contendo pelo lentamente retirando-o do neurónio. </li><li> Deixar a preparação de cerca de 30 minutos para permitir que o corante se difunda nos processos finos que fazem contacto com sináptico neurónios do seguidor. </li></ol> 4. Imagem de cálcio e gravação eletrofisiológico <ol><li> Colocar a preparação no Microsc imagingope. O prato com a preparação é realizada em uma plataforma de arrefecimento com pedaços de Permagum cordão de vedação que, ao contrário de argila, mantém-se pegajoso quando molhado. O microscópio palco fixo concentra movendo o objetivo. A fase permanece estacionário, o que permite anexar manipuladores magnéticos montados. Como a alta ampliação torna vibrações (especialmente o movimento lateral) um problema, a configuração de imagem inteiro deve ser colocado sobre uma plataforma de isolamento de vibração. </li><li> Empalar os neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos com eletrodos contendo solução eletrolítica normal. </li><li> Selecione um bloco de filtro adequado para a imagem de cálcio Laranja (excitação 549 nm, nm de emissão 576) 8 e ajustar a câmera. A maioria das câmeras CCD científicos permitem que o investigador de escolher um subconjunto de células CCD que são lidos fora. Além disso, as células podem ser combinados (binned). A seleção de um subconjunto menor velocidade aumenta, enquanto binning aumenta a sensibilidade. Estas duas configurações, em conjunto com o tempo de exposição, determinara taxa de quadros ou seja, quantas imagens podem ser adquiridas por segundo. Configurações adequadas imagem será uma área de 580 x 350 um 2 com 500 x 300 pixels (usando uma lente de 10x e um adaptador de câmera 0,5 x). Adicionar filtros de densidade neutra ao caminho de luz para ajustar a intensidade de iluminação para a quantidade mínima que proporciona a exposição correcta com um tempo de exposição de &lt;25 ms. Estas definições devem resultar em uma taxa de quadros de cerca de 30 Hz - que na Aplysia é rápido o suficiente para a imagem pico único evocado alterações de cálcio. Finalmente, feche a abertura de campo de modo que apenas a área fotografada é iluminado. </li><li> No software de imagem de marcar regiões do neurônio que deseja medir. No Elements AR software isso é feito no &quot;Tempo de medição&quot; seção colocando regiões de interesse (ROI). B21 é um neurônio bipolar e trabalho anterior demonstrou que os seus contatos processo lateral neurônio pós-sináptico de juros de 9. Nós geralmente imagem sutiã, primário, secundário e terciárionches do processo de colocação de um perfil por ROI sobre cada parte do neurónio. Um ROI adicional ao lado do neurónio corante cheio é medido para proporcionar um valor de fundo, que é depois subtraída de todos os outros pontos de dados. </li><li> Instrua a aquisição de eletrofisiologia (nestes experimentos de Spike II) para aguardar um sinal de disparo fornecida pelo &quot;quadro de leitura&quot; do sinal da câmera. Iniciar a aquisição de imagem (Elementos AR); Ponto II irá automaticamente iniciar a gravação quando a câmera tira seu primeiro quadro. Você também pode usar uma saída TTL do Poder 1401 brevemente ligar um LED montado na porta do microscópio câmera. Isto irá proporcionar um sinal de sincronização de imagem e subsequentemente dados electrofisiológicos. </li><li> Estimular o neurônio pré-sináptico, injetando uma série de breves despolarizantes pulsos de corrente na freqüência desejada. É importante para controlar cada impulso (por exemplo, com um osciloscópio estímulo provocado) para determinar se o potencial de acção é successfully gerado. Enquanto Laranja cálcio é muito foto-estável em relação a outros corantes, é uma boa idéia para gravar um ensaio clínico sem estimulação para verificar a quantidade tingir branqueamento ocorre. </li><li> Em experiências nas quais as concentrações de cálcio intracelular são manipulados, uma droga tal como EGTA é introduzido no neurónio pré-sináptico e das etapas de estimulação e de aquisição de dados descritos acima são repetidos. </li></ol> 5. Análise de dados representativos <ol><li> Exportar os dados de imagem (a lista de valores de intensidade medidos para cada ROI) escrevendo em um arquivo de texto. Um script personalizado de Spike II pode importar o arquivo de texto. Este script também normaliza os valores da sonda com área individual e subtrai o valor da sonda do fundo. Os pontos de dados são, em seguida, juntamente com os dados representados como uma electrofisiologia &quot;virtual RealWave&quot; do canal. O &quot;canal processo / função de mudança de tempo&quot; no filme de Spike II é usada para alinhar precisamente a imagem de dados points, ​​utilizando o sinal de LED como referência. </li><li> Para obter os valores como percentagem de alteração, analisar os dados de imagem por meio do cálculo da variação relativa da fluorescência como dF / o = F (FF o) / F o. F o indica o nível de fluorescência antes do estimulo e F a fluorescência durante o estímulo. </li></ol> 6. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema geral da experiência. As experiências são realizadas em preparações ganglionares de Aplysia. Alterações de cálcio intracelular são gravadas com um corante fluorescente, que é introduzido no iontoforeticamente o neurónio pré-sináptico. Neurónios pré-e pós-sinápticos são então empalado com eléctrodos afiadas, de modo que a transmissão sináptica pode ser induzida e controlada. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. imagem de cálcio intracelular e gravação de neurônios identificados no gânglio vestibular de Aplysia. (A) Foto do ramo imaged lateral do neurônio B21. A caixa indica a região medida de interesse. (B1) estimulação intracelular de B21 evoca potenciais de ação (traço inferior) e facilitando potenciais pós-sinápticos (PSP) no pós-sináptica dos neurônios seguidor B8 (meio de rastreamento) fazendo com que ele também disparar potenciais de ação. Aumentos na fluorescência de cálcio pré-sináptica são mostrados no traçado superior. (B2) Efeito do EGTA pré-sináptica na facilitação homossináptica significa. EGTA foi intracelularmente injectado B21 ~ 15 minutos antes da estimulação intracelular. Pensa-se que EGTA é um quelante de cálcio de acção lenta, que a baixas concentrações não é suficientemente rápida para eliminar a transmissão sináptica. Note-se a redução do sinal de cálcio generalizada e a correspondente diminuição da amplitude PSP. (C) A amplitude PSP correlaciona-se com a pré-sináptica calcium sinal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Nós demonstramos técnicas que podem ser usadas para controlar simultaneamente a concentração de cálcio intracelular e avaliar a eficácia da transmissão sináptica. Estas técnicas são úteis para determinar o modo como diversas formas de plasticidade de curto prazo são mediados. A formação de imagens é realizada com um microscópio de fluorescência e câmara CCD. Estes requisitos equipamentos são relativamente modestos quando comparados com a maioria funcionais de imagem set-up...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Cálcio Laranja </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Cálcio kit padrão de calibração </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> útil para testar a sensibilidade e a gama dinâmica do sinal </td></tr><tr><td> Hexa-hidrato de cloreto de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilizado em solução 0,33 M de anestesiar animais </td></tr></tbody></table> Reagentes Tabela 1. Usado. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> FN-1 microscópio vertical fluorescência </td><td> Nikon Instruments </td><td> com Narishige ITS-FN1 etapa </td></tr><tr><td> NMN-21 manipuladores </td><td> Narishige </td><td> montado no palco com ímãs </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 câmera CCD </td><td> Fotometria </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementos AR (Versão 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> software de imagem usado para adquirir dados de fluorescência </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plano Fluor objetivo </td><td> Nikon Instruments </td><td> esta lente de imersão em água tem uma longa distância de trabalho de 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lâmpadas de metal haleto PC </td><td> EXFO </td><td> utilizado para imagiologia de fluorescência </td></tr><tr><td> LS-DWL lâmpada halógena </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 conjunto de filtros </td><td> Tecnologia Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> Poder 1401 conversor A / D </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> amostragem foi feita em 3 kHz </td></tr><tr><td> Ponto II (Versão 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> software usado para adquirir dados de eletrofisiologia </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificador </td><td> NPI eletrônica </td><td> usado com um andar de entrada 10X </td></tr><tr><td> Amplificador modelo 410 </td><td> Brownlee precisão </td><td> utilizado para amplificar e filtrar o sinal </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> menos k Tecnologia </td><td> isolamento de vibração para imagens </td></tr><tr><td> plataforma de resfriamento </td><td> feitos </td><td> placa de metal através do qual é bombeada água gelada, a uma taxa variável </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Equipamento utilizado.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Tem sido sugerido que alterações no cálcio intracelular mediar a indução de um certo número de importantes formas de plasticidade sináptica (facilitação, por exemplo homossináptica significa) 1. Estas hipóteses podem ser testadas simultaneamente monitorizar alterações de cálcio intracelular e alterações na eficácia sináptica. Nós demonstrar como este pode ser realizado através da combinação de imagens com as técnicas de gravação de cálcio intracelulares. Nossos experimentos são realizados em um gânglio vestibular do molusco Aplysia californica. Esta preparação tem um número de características vantajosas, experimentalmente: Ganglia pode ser facilmente removido do Aplysia e experimentos usar neurónios adultos que fazem conexões sinápticas normais e têm uma distribuição normal do canal de iões. Devido à baixa taxa metabólica do animal, e as temperaturas relativamente baixas (14-16 ° C) que são naturais para Aplysia, as preparações são estáveis ​​durante longos períodos de tempo. &gt; ent &quot;Para detectar alterações de cálcio intracelular livre, vamos utilizar a versão celular impermeante de cálcio Orange 2, que é facilmente&quot; carregado &quot;em um neurônio através de iontoforese. Quando este corante fluorescente de comprimento de onda longo liga ao cálcio, aumenta a intensidade de fluorescência. cálcio Orange tem rápidas propriedades cinéticas 3 e, ao contrário de corantes raciométrica (por exemplo, Fura 2), não requer nenhuma roda de filtros para imagens. É bastante foto estável e menos fototóxica do que outros corantes (por exemplo, fluo-3) 2,4. Assim como todos os não-raciométrica corantes, cálcio Laranja indica alterações relativas na concentração de cálcio. Mas, uma vez que não é possível em conta as variações na concentração de corante, devido às operações de carga e de difusão, que não pode ser calibrado para proporcionar as concentrações de cálcio absolutos. Uma posição vertical, fixo platina do microscópio composto, foi utilizado para os neurónios de imagem com uma câmara CCD capaz de gravação de cerca de 30 quadros por segundo. Em Aplysia esta resolução temporalé mais do que adequada para detectar mesmo um único pico de alteração induzida na concentração de cálcio intracelular. Eletrodos pontiagudos são simultaneamente usado para induzir e gravar a transmissão sináptica em neurônios identificados pré e pós-sináptica. Na conclusão de cada teste, um script personalizado combina eletrofisiologia e dados de imagem. A fim de assegurar a sincronização adequada usamos um pulso de luz a partir de um diodo emissor de luz montado na porta da câmara do microscópio. Manipulação dos níveis de cálcio pré-sinápticos (por exemplo, através da injeção intracelular EGTA) nos permite testar hipóteses específicas, sobre o papel do cálcio intracelular na mediação de várias formas de plasticidade.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Demonstramos como alterações na concentração do cálcio intracelular livre e eficácia sináptica podem ser monitorizados simultaneamente num gânglio de preparação<em&gt; Aplysia</em&gt;. Nós imagem de cálcio intracelular utilizando um corante fluorescente, o laranja de cálcio, e induzir e controlar a transmissão sináptica, com cortantes (intracelular) eléctrodos.

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

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Research

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Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K visualizações.  Mt. Sinai School of Medicine. Demonstramos como alterações na concentração do cálcio intracelular livre e eficácia sináptica podem ser monitorizados simultaneamente num gânglio de preparação Aplysia. Nós imagem de cálcio intracelular utilizando um corante fluorescente, o laranja de cálcio, e induzir e controlar a transmissão sináptica, com cortantes (intracelular) eléctrodos.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurociência

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

Carregando uma tintura de cálcio em terminação de nervo de sapo através do coto nervoso: Registro de transientes de cálcio na união neuromuscular de sapo

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.