גרנט PHS (MH51393) תמך עבודה זו. חלק מAplysia אנו משתמשים מסופקים על ידי המשאבים הלאומיים לAplysia של אוניברסיטת מיאמי תחת גרנט RR10294 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, NIH.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את החיה על ידי הזרקת תמיסת 75-100 מ&quot;ל איזוטוני מגנזיום כלוריד. Aplysia אנו משתמשים להדמיה הן בדרך כלל 150-200 גרם והם מתקבלים ממרינוס המדעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את החיה המורדמת לצלחת מכוסית שעווה. מחטי מזרקים לעבוד היטב למטרה זו; טכניקות סטריליות אינן נחוצות. שימוש במלקחי ברוטו ומספריים רגילים עושה חתך ברגלו של בעל החיים ולחשוף את מסת buccal. אתר גנגליון buccal. בעזרת מספרי האביב ומלקחיים עדינים, בזהירות חופשיה גנגליון על ידי חיתוך את כל עצבי buccal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מרכז העצבים ולמקם אותו בצלחת מצופית Sylgard המכילה מי ים מלאכותי. הנח כמה סיכות חרקים דרך עצבי buccal לייצב גנגליון. Desheath גנגליון buccal באמצעות מלקחיים ומספריים ultrafine אביב, כדי לחשוף את תאי העצב להקלטה תאית. ואז שוב להצמיד גנגליון באמצעות כ 15 חרקים בסדר (דקותסיכות) utien. גנגליון חייב להיות מוחזק היטב במקומו כמו כל תנועה תהיה בעייתית במהלך ההדמיה. </li></ol> 2. הכן אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך האלקטרודות באמצעות צינור נימי זכוכית עם נימה (למשל WPI TW100F-4) ומושך. הגדרות צריכות להיקבע בנפרד כדי ליצור אלקטרודות של ההתנגדות הנדרשת. כאשר התמלא M 3 KAC (יצטט אשלגן) התנגדות האלקטרודה שלנו היא בדרך כלל כ 10 MOhms אם האלקטרודות הן להיות משופעות, או כ 5 MOhms אם הצעד המשופע מושמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא קבוצה אחת של אלקטרודות עם תמיסה המכילה KCl M 3 KAc/30 mM שימוש במזרק ומחט microfil. אלקטרודות אלה ישמשו לelectrophysiology. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא סט שני של אלקטרודות עם צבע מחוון הסידן על ידי טבילת הקצה האחורי של האלקטרודה בצבע, בעבר מחדש עם כ. 40 מים מזוקקים μl לצבע 500μg. כאשר הקצה של האלקטרודה מלא, חזרה למלא כ 1/4 אינץ&#39;בסופו של אלקטרודה עם 200 מ&quot;מ KCl כדי להבטיח מגע חשמלי טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה מועיל לפוע האלקטרודות, כמו זו מאפשרת הזרקת צבע ומקטינה על ידי חדירות הממברנה מרובות הניזק. אנו משתמשים beveler מותאם אישית שיוצר זרם של השעית מים / מלח אבקת אלומינה. אלקטרודה היא רכובה בבעל וקצו נכנס לזרם בזווית ° 45. התנגדות אלקטרודה מנוטרת באופן רציף והמשופעת הסתיים כאשר ההתנגדות מגיעה כ 5 MOhm לKAC אלקטרודות מלאות. האלקטרודות המלאות הצבע הם משופעים לכמות שווה של זמן ובדרך כלל יש התנגדויות של MOhm 15-20. </li></ol> 3. טוען דיי אינדיקטור סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ההכנה על אסדת electrophysiology וחזותי לאתר נוירון presynaptic של עניין. רבים מהניסויים שלנו נעשים עם נוירון חושי זיהה מנוצל במהלך האכלה, 5 B21, 6. Positio הקבוע יחסיתn, גודל (~ 100 מיקרומטר), וצורתו המוארכת של סומה של B21 לעשות את זה קל לאתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשפד נוירון עניינים עם אלקטרודה המכילה צבע מחוון סידן. זהותו של B21 יכולה להיות מאומתת על ידי impaling נוירון B8 הפוסט סינפטי. שלילת קוטביות של B21 עם 8 ~ נוכחי Na תפעיל קוצים ואת התוצאה בהנחיית PSPs ב7 B8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזריק צבע בנוירון presynaptic של עניין על ידי העברת פולסים hyperpolarizing (בדרך כלל -15 Na, 1 הרץ, 75% המחזור) למשך כ 30 דקות. אם טעינת צבע היא מוצלחת, סומה של נוירון תרכוש צבע ורוד חיוור. הסר את האלקטרודה צבע המכיל על ידי נסיגתו באיטיות מתא העצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר הכנות לכ 30 דקות על מנת לאפשר לצבע כדי לפזר לתוך התהליכים העדינים שהופכים את קשר הסינפטי עם הנוירונים חסיד. </li></ol> 4. דימות סידן והקלטת אלקטרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ההכנה על הדמית microscאופ. הצלחת עם ההכנה מתקיימת על פלטפורמת קירור עם חתיכות של כבל האיטום Permagum אשר, בניגוד חימר, נותרת דביק כאשר רטוב. מיקרוסקופ הבמה הקבועה מתמקד ידי הזזה האובייקטיבית. השלב נשאר נייח, המאפשר חיבור המניפולטורים מגנט רכוב. כהגדלה הגבוהה הופכת את התנודות (תנועה לרוחב בעיקר) בעייתית, התקנת ההדמיה כולו צריכה להיות ממוקמת על פלטפורמת בידוד רעידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפד את הנוירונים presynaptic וpostsynaptic עם אלקטרודות המכילות תמיסת אלקטרוליט נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלוק מתאים לתמונת סידן אורנג&#39; מסנן (עירור 549 ננומטר, 576 ננומטר פליטה) 8 ולהתאים את המצלמה. מצלמות CCD המדעיות ביותר את החוקר לבחור תת קבוצה של תאי CCD, כי הם נקראו החוצה. בנוסף, תאים יכולים להיות משולבים (זרק לפח). בחירה קטנה יותר מהירות עליות משנה, תוך רגישות עליות binning. שתי הגדרות אלה, ועם זמן החשיפה, לקבועקצב הפריימים כלומר כמה תמונות ניתן לרכוש בשנייה. הגדרות מתאימות יהיה תמונה על שטח של 350 מיקרומטר 580 x 2 עם 500 x 300 פיקסלים (באמצעות עדשת 10x ומתאם מצלמה 0.5x). הוסף מסנני צפיפות ניטראליות לנתיב האור כדי להתאים את עוצמת התאורה לכמות המינימאלית המספקת חשיפה נכונה בזמן חשיפה &lt;25 אלפיות שני. הגדרות אלה צריכות לגרום לקצב פריימים של 30 רץ - אשר בAplysia מספיק מהיר כדי תמונה האחת ספייק עורר שינויי סידן. לבסוף, לסגור את צמצם השדה כך שרק אזור ההדמיה דולקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת ההדמיה לסמן האזורים של נוירון אתה רוצה למדוד. באלמנטי AR התוכנה זה נעשה בסעיף &quot;מדידת הזמן&quot; על ידי צבת אזורים של עניין (Rois). B21 הוא דו קוטבי ונוירון עבודה קודמת הוכיחה כי מגעי התהליך הרוחביים שלה נוירון postsynaptic עניין 9. אנחנו בדרך כלל תמונה ראשונית, שניונית, שליישוני חזייהnches של התהליך הרוחבי על ידי צבת ROI על כל חלק של תא העצב. החזר על השקעה נוספת בסמוך לנוירון המלא הצבע נמדד כדי לספק ערך רקע שנגרע מאוחר יותר מכל נקודתי נתונים האחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות לרכישת electrophysiology (בניסויים אלה ספייק השני) כדי לחכות לאות הדק מסופקת על ידי האות &quot;מסגרת readout&quot; של המצלמה. התחל רכישת התמונה (האלמנטים AR); ספייק השני עכשיו אוטומטית להתחיל להקליט כאשר המצלמה המצלמת הפריים הראשון שלה. ניתן גם להשתמש בפלט TTL של המעצמה 1401 בקצרה כדי להפעיל LED רכוב ביציאת המצלמה של מיקרוסקופ. זה יספק אות לאחר מכן לסנכרן את נתוני הדמיה ואלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את הנוירון presynaptic ידי הזרקת סדרה של פולסים הנוכחיים depolarizing קצרים בתדירות הרצויה. חשוב לעקוב אחר דופק בכל (למשל עם אוסצילוסקופ גירוי מופעל) כדי לקבוע אם פוטנציאל פעולה הוא successfנוצר ully. בעוד אורנג&#39; סידן הוא מאוד צילום יציב בהשוואה לצבעים אחרים, זה רעיון טוב להקליט משפט שליטה ללא גירוי לבדוק כמה לצבוע הלבנה מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים שבם ריכוז יוני הסידן התאי הוא מניפולציה, תרופה כגון EGTA מוחדרת לתא עצב presynaptic ואת פעולות רכישת הגירוי ונתונים שתוארו לעיל חוזרת על עצמם. </li></ol> 5. ניתוח של נתונים יציגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את נתוני ההדמיה (רשימת הערכים שנמדדו בעצמה לכל החזר על השקעה) על ידי כתיבה אותו לקובץ טקסט. תסריט מותאם אישית בספייק השני יכול לאחר מכן לייבא את קובץ הטקסט. סקריפט זה גם מנרמל את הערכים באזור של הבדיקה הפרטנית, ומחסיר את הערך של בדיקת הרקע. נקודתי הנתונים אז הם זממו לצד נתוני electrophysiology כערוץ &quot;וירטואלי RealWave&quot;. &quot;תהליך / תפקוד היסט זמן הערוץ&quot; בספייק השני משמש בדיוק ליישר הדמית הנתונים פויNTS, תוך שימוש באות LED כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל ערכים כמו שינוי אחוזים, לנתח את נתוני הדמיה על ידי חישוב השינוי היחסי בפלואורסצנטי כDF / F = o (FF o) / F o. F o מציינת את רמת פלואורסצנטי ממש לפני הגירוי וF פלואורסצנטי במהלך הגירוי. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. ניסויים נערך בהכנת גנגליון של Aplysia. שינויים בסידן תוך תאי הם צלמו בצבע זרחני, שהציג iontophoretically לתוך הנוירון סינפטי. הנוירונים מראש וpostsynaptic מכן משופדים עם אלקטרודות חדות כל כך יכולה להיגרם כי העברה הסינפטית ופיקוח. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="איור 2" /> <strאונג&gt; איור 2. הדמית סידן והקלטה תאית מתא עצב שזוהה בגנגליון buccal של Aplysia. (א) תמונה של הענף הצדדי ההדמיה של נוירון B21. התיבה מציינת את האזור המדוד של ריבית. גירוי (B1) תאי של B21 מעורר פוטנציאל פעולה (עקבות תחתונות) ופוטנציאלי postsynaptic הקלה (PSPs) בחסיד postsynaptic נוירון B8 (באמצע עקבות) גורם לו גם לירות פוטנציאלי פעולה. עליות בפלואורסצנטי הסיד presynaptic מוצגות בשמץ העליון. אפקט (B2) של EGTA presynaptic בהנחיית homosynaptic. EGTA הוזרק לתוך intracellularly B21 ~ 15 דקות לפני הגירוי תאי. הוא חשב כי EGTA הוא chelator איטי פועל הסיד, אשר בריכוזים נמוכים הוא לא מהיר מספיק כדי לדכא את ההולכה סינפטית. שים לב לירידה באות הסיד הנרחבת וירידה המקבילה בPSP משרעת. (ג) משרעת PSP קורלציה עם calciu presynapticמ &#39;אות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

אנו מדגימים טכניקות שניתן להשתמש בו זמנית לפקח על ריכוז הסידן התוך התאי ולהעריך את היעילות של העברה הסינפטית. שיטות אלה מועילות לקביעה כיצד צורות שונות של פלסטיות לטווח קצר מתווכות. ההדמיה מבוצעת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמת...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> הערה </td></tr><tr><td> הסיד אורנג&#39; </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמא </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת חיץ כיול סידן </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> שימושי לבדיקת הרגישות והטווח דינמי של האות </td></tr><tr><td> hexahydrate מגנזיום כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> M0250 </td><td> השתמש בתמיסת 0.33 M להרדים בעלי חיים </td></tr></tbody></table> לוח 1. ריאגנטים שימוש. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד </td><td> חברה </td><td> הערה </td></tr><tr><td> FN-1 מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף </td><td> ניקון מכשירים </td><td> עם Narishige-FN1 ITS השלב </td></tr><tr><td> לענ-21 המניפולטורים </td><td> Narishige </td><td> רכוב על במה עם מגנטים </td></tr><tr><td> מצלמת 2 CoolSNAP HQ CCD </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> ח האלמנטים AR (גרסה 3.22) </td><td> ניקון מכשירים </td><td> תוכנת הדמיה משמשת לרכישת נתוני קרינה </td></tr><tr><td> 10X/0.3w תכנית פלואוריד אובייקטיבי </td><td> ניקון מכשירים </td><td> עדשת טבילה במים זה יש מרחק עבודה ארוך מאוד של 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> X-Cite מנורה הליד מתכת מחשב 120 </td><td> EXFO </td><td> משמש לדימות פלואורסצנטי </td></tr><tr><td> LS-DWL מנורת הלוגן </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> קבוצת ET-CY3 מסנן </td><td> טכנולוגית Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> כוח 1401 / D ממיר </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td> הדגימה נעשתה ב 3 קילוהרץ </td></tr><tr><td> ספייק השני (גרסה 7.07) </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td> תוכנה המשמשת לאיסוף נתוני electrophysiology </td></tr><tr><td> SEC LX-10 מגבר </td><td> NPI אלקטרוניקה </td><td> בשימוש עם headstage 10X </td></tr><tr><td> 410 מגבר דגם </td><td> ראונלי דיוק </td><td> משמש כדי להגביר את האות ולסנן </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> מינוס k טכנולוגיה </td><td> בידוד רעידות הדמיה </td></tr><tr><td> פלטפורמת קירור </td><td> המנהג עשה </td><td> לוחית הנחושת שדרכו מי קרח נשאבים בשיעור משתנה </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ציוד משומש.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

היה מי שהציע כי שינויים בסידן תאי לתווך אינדוקציה של מספר הצורות חשובות של פלסטיות הסינפטית (הנחיית למשל, homosynaptic) 1. השערות אלה ניתן לבדוק על ידי ניטור שינויים בסידן תוך תאי ושינויים ביעילות הסינפטית בו זמנית. אנו מדגימים כיצד זה יכול להתבצע על ידי שילוב הדמית סידן עם טכניקות הקלטה תאיות. הניסויים שלנו מתנהלים בגנגליון buccal של Aplysia californica הרכיכה. הכנה זו כוללת מספר התכונות מועילות בניסוי: גרעינים ניתן להסיר בקלות מAplysia וניסויים להשתמש תאי עצב בוגרים המרכיבים קשרים סינפטיים רגילים ויש לי ערוץ הפצת יון רגילה. בשל שיעור הנמוך מטבולים של בעלי החיים והטמפרטורות הנמוכות יחסית (14-16 מעלות צלזיוס) שהנם טבעיים לAplysia, הכנות הן יציבות לפרקי זמן ארוכים. &gt; אף אוזן גרון &quot;כדי לזהות שינויים בסידן חופשי תאי אנו משתמשים בגרסת impermeant התא של סידן אורנג&#39; 2 אשר בקלות&quot; נטען &quot;לנוירון באמצעות iontophoresis. כאשר צבע אורך גל ניאון ארוך זה נקשר לסידן, עולה עוצמת קרינה. הסיד אורנג&#39; יש תכונות מהירות הקינטית 3 ו, בניגוד לצבעי ratiometric (למשל, Fura 2), לא דורשות גלגל מסנן עבור הדמיה. זה די תמונה יציבה ופחות phototoxic מצבעים אחרים (למשל, Fluo-3) 2,4. כמו כל הלא ratiometric צבעים, סידן אורנג&#39; מציין שינויים יחסיים בריכוז הסידן. אבל, מכיוון שלא ניתן להסביר את השינויים בריכוז צבע עקב טעינה ודיפוזיה, זה לא יכול להיות מכויל לספק ריכוז יוני הסידן מוחלט. במה, מיקרוסקופ זקוף, קבוע מתחם שמש לנוירונים תמונה עם מצלמה מסוגלת להקליט סביב 30 מסגרות לשנייה CCD. בAplysia הרזולוציה של הזמן הזההוא יותר ממספק כדי לזהות אפילו שינוי מושרה ספייק יחיד בריכוז הסידן התוך התאי. אלקטרודות שארפ משמשות בו זמנית כדי לגרום ולהקליט שידור סינפטי בנוירונים לפני וpostsynaptic מזוהים. בסיומו של כל משפט, תסריט מותאם אישית משלב נתוני ההדמיה electrophysiology ו. כדי להבטיח סינכרון ראוי אנו משתמשים דופק אור LED הרכוב בנמל המצלמה של המיקרוסקופ. מניפולציה של רמות הסידן presynaptic (למשל, באמצעות הזרקת EGTA תאית) מאפשרת לנו לבחון את השערות ספציפיות, הנוגע לתפקידו של הסידן תוך תאי בתיווך צורות שונות של פלסטיות.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של גנגליון<em&gt; Aplysia</em&gt;. אנחנו תמונת הסידן תוך תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי, אורנג&#39; סידן, ולעורר ולפקח על העברה הסינפטית עם אלקטרודות חדות (תאי).

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K Views.  Mt. Sinai School of Medicine. אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של גנגליון Aplysia. אנחנו תמונת הסידן תוך תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי, אורנג' סידן, ולעורר ולפקח על העברה הסינפטית עם אלקטרודות חדות (תאי).

Video: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.