Un agradecimiento especial a Kris Reddi en la UCLA para la creación de reactivos y verter los geles y Erin Sanders en la UCLA en busca de inspiración, guía y apoyo y la corrección del manuscrito. También me gustaría que gracias Giancarlo Costaguta y Gregory S. Payne para suministrar el ADN genómico de la levadura y los cebadores para amplificar el gen GAL3. También me gustaría dar las gracias a Shah Bhairav ​​para tomar fotografías de los equipos de laboratorio y los reactivos utilizados para hacer las figuras 2 a 4. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el HHMI (HHMI Grant N º 52.006.944).

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No tengo nada que revelar.

PCR se ha convertido en una herramienta indispensable en el arsenal de la ciencia biológica. PCR ha alterado el curso de la ciencia que permite a los biólogos a ceder el poder sobre los genomas, y hacer que los genes híbridos con nuevas funciones, permitiendo que las pruebas clínicas específicas y precisas, obteniendo conocimientos sobre los genomas y la diversidad, así como los genes simplemente de clonación para el análisis bioquímico más. Aplicación de la PCR está limitado sólo por la imaginación de los científicos que ejerce su poder. Hay muchos libros y artículos que describen los nuevos usos especializados de la PCR, y muchos más que se desarrollará en la próxima generación de la ciencia biológica. Sin embargo, independientemente de los enfoques previstos, el marco fundamental se ha mantenido el mismo. PCR, en toda su grandeza, es una aplicación in vitro para generar grandes cantidades de un segmento específico de ADN. El diseño de un experimento de PCR requiere de pensamiento y de paciencia. Los resultados mostrados en la Figura 3 ejemplifican uno de los canales principalesallenges la hora de diseñar una estrategia de optimización para la PCR. Es decir, como un parámetro de la PCR se cambia, puede afectar a otra. Como un ejemplo, si la PCR inicial se llevó a cabo a la temperatura sub-óptima de recocido (58 ° C) con un óptimo de Mg 2 + concentración de 2,0 mM, a continuación, el resultado sería producir un frotis como se ve en la Figura 3c. Un intento de resolver el frotis puede implicar la creación de las condiciones de PCR con las reacciones que contienen 2,0 mM MgCl 2 y el ajuste de la temperatura de templado a 61 ° C. Sin embargo, como se ve en la Figura 3a, esto no produciría ningún producto. En consecuencia, es aconsejable titular reactivos, en lugar de añadir una concentración a una sola reacción, cuando reparación resultados falsos. Además, los ajustes más comunes que se requieren para la optimización de un experimento de PCR son para cambiar el Mg 2 + concentración y para corregir las temperaturas de recocido. Sin embargo, si estos cambios no minimizar o anular los resultados aberrantes, la valoración de additiVES y / o cambiar los protocolos de la condición de ciclismo que se describen en las Tablas 2-6 puede aliviar el problema. Si todo esto falla, rediseñar los cebadores y de intentar, intentar de nuevo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> Sigma </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml de paredes delgadas tubos PCR </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml de pared delgada tapones de los tubos </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA disódico dihidrato de la sal </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Custom Fago </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> Primer Custom Fago </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> Primer levadura personalizada </td><td> Integrado de Tecnologías de ADN </td><td colspan="2"> SacI Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> Primer levadura personalizada </td><td> Integrado de Tecnologías de ADN </td><td colspan="2"> Gal3 (1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Bio Rad </td><td> 170-9703 </td><td> Mi Ciclador </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> La electroforesis en gel </td><td> Hoeffer Scientific Instruments </td><td> Modelo HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 kb DNA Ladder </td><td> New England BioLabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> Bio Rad Power Pack </td><td> Bio Rad </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac básica </td></tr><tr><td> Gel Doc sistema de </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> FOTO / Analista Investigador FX estación de trabajo </td></tr></tbody></table>

polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies

En las ciencias biológicas se han producido avances tecnológicos que catapultan a la disciplina en las edades de oro del descubrimiento. Por ejemplo, el campo de la microbiología se transformó con el advenimiento de microscopio Anton van Leeuwenhoek, que permitió a los científicos visualizar procariotas, por primera vez. El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las innovaciones que cambiaron el curso de la ciencia molecular, con el impacto que abarca un sinnúmero de subdisciplinas de la biología. El proceso teórico fue esbozada por Keppe y compañeros de trabajo en 1971, sin embargo, fue otro de 14 años hasta que el procedimiento completo de PCR se describe y se aplica experimentalmente por Kary Mullis, mientras que en la Cetus Corporation en 1985. Automatización y refinamiento de esta técnica progresó con la introducción de una ADN polimerasa térmica estable a partir de la bacteria Thermus aquaticus, en consecuencia, el nombre de la ADN polimerasa Taq. La PCR es una Powetécnica de amplificación rful que puede generar un amplio suministro de un segmento específico de ADN (es decir, una amplificación) a partir de sólo una pequeña cantidad de material de partida (es decir, molde de ADN o secuencia diana). Si bien sencilla y, en general sin problemas, hay dificultades que complican la reacción que produce resultados falsos. Cuando la PCR no se puede llevar a muchos productos no específicos de ADN de diferentes tamaños que aparecen como una escalera o un frotis de bandas en geles de agarosa. A veces hay productos forman en absoluto. Otro problema potencial se produce cuando las mutaciones se introdujeron involuntariamente en los amplicones, resultando en una población heterogénea de productos de PCR. Los fallos de la PCR puede ser frustrante no ser la paciencia y la solución de problemas de cuidado se emplean para resolver y solucionar el problema (s). Este protocolo describe los principios básicos de la PCR, proporciona una metodología que se traducirá en la amplificación de secuencias de la mayoría de objetivo, y presenta estrategias para la optimización de una reacción. Siguiendo esta guía de PCR, víaudents debe ser capaz de: <ul><li> Establecer las reacciones y las condiciones de ciclos térmicos convencionales para un experimento de PCR </li><li> Comprender la función de varios componentes de la reacción y su efecto global sobre un experimento de PCR </li><li> Diseñar y optimizar un experimento de PCR para cualquier molde de DNA </li><li> Solucionar problemas de fallidos experimentos de PCR </li></ul>

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Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

PCR se ha convertido en una técnica común en muchos laboratorios de biología molecular. Siempre que aquí hay una guía rápida de varios protocolos de PCR convencionales. Debido a que cada reacción es un experimento único, las condiciones óptimas requeridas para generar un producto variar. La comprensión de las variables en una reacción en gran medida mejorar la eficiencia de la solución de problemas, lo que aumenta la posibilidad de obtener el resultado deseado.

Reacción en cadena: Protocolo Básico Plus Estrategias de resolución de problemas y optimización

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

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399.0K vistas.  University of California, Los Angeles. PCR se ha convertido en una técnica común en muchos laboratorios de biología molecular. Siempre que aquí hay una guía rápida de varios protocolos de PCR convencionales. Debido a que cada reacción es un experimento único, las condiciones óptimas requeridas para generar un producto variar. La comprensión de las variables en una reacción en gran medida mejorar la eficiencia de la solución de problemas, lo que aumenta la posibilidad de obtener el resultado deseado...