Besonderen Dank an Kris Reddi an der UCLA für die Einrichtung Reagenzien und Gele gießen und auf Erin Sanders an der UCLA für Inspiration, Anleitung und Unterstützung und das Korrekturlesen des Manuskripts. Ich würde auch dank Giancarlo Costaguta und Gregory S. Payne gerne zur Versorgung der Hefe genomischer DNA und Primer, die GAL3 Gens zu amplifizieren. Ich möchte auch Bhairav ​​Schah zur Aufnahme von Bildern der Laborgeräte und Reagenzien verwendet, um Abbildungen 2 machen danke - 4. Finanzierung für dieses Projekt wurde von HHMI (HHMI Grant Nr. 52006944) zur Verfügung gestellt.

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	<li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+sensitive,+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers.">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li><li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content.">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li><li>Blanchard, M. 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Ich habe nichts zu offenbaren.

PCR hat sich zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der biologischen Wissenschaft Arsenal. PCR hat den Kurs der Wissenschaft verändert Biologen erlaubt, Macht über die Genome liefern, und machen Hybrid-Gene mit neuartigen Funktionen, so dass spezifische und genaue klinische Tests, Einblicke in Genome und Vielfalt, sowie einfach Klonierung von Genen für die weitere biochemische Analyse. PCR-Anwendung wird nur durch die Phantasie des Wissenschaftlers, der seine Macht ausübt begrenzt. Es gibt viele Bücher und Papiere, die neue spezialisierte Anwendungen der PCR zu beschreiben, und viele mehr werden über die nächste Generation der biologischen Wissenschaft entwickelt werden. Doch unabhängig von den erwarteten Ansätzen hat sich die fundamentalen Rahmenbedingungen die gleichen geblieben. PCR, in seiner ganzen Größe, ist ein in vitro-Anwendung, große Mengen an ein bestimmtes Segment der DNA zu erzeugen. Entwerfen einer PCR-Experiment erfordert Denken und Geduld. Die Ergebnisse in Abbildung 3 dargestellt beispielhaft eine der wichtigsten challenges bei der Konzeption einer Optimierungsstrategie für die PCR. Das heißt, als ein Parameter der PCR geändert wird, kann das Einfluss auf andere. Als Beispiel, wenn der erste PCR wurde bei einer suboptimalen Glühtemperatur (58 ° C) mit einem optimalen Mg 2 +-Konzentration von 2,0 mM, dann ist das Ergebnis würde ein Abstrich, wie in 3c zu sehen. Ein Versuch, die Schmierschicht auflösen könnte erfordert den Aufbau PCR-Bedingungen mit Reaktionen, die 2,0 mM MgCl 2 und Anpassung der Annealingtemperatur auf 61 ° C. Jedoch, wie in Abbildung 3a zu sehen, würde dies zu keinem Produkt. Folglich ist es ratsam, Reagenzien titrieren, anstatt das Hinzufügen einer Konzentration auf eine einzige Reaktion, bei der Fehlersuche falschen Ergebnissen. Außerdem sind die häufigsten Anpassungen, die für die Optimierung eines PCR-Experiment erforderlich sind, um die Mg 2 +-Konzentration zu verändern und die Härtungstemperaturen zu korrigieren. Allerdings, wenn diese Änderungen nicht minimieren oder aufzuheben falschen Ergebnissen, die Titration von additives und / oder Verändern der Radsport Zustand Protokolle wie in den Tabellen 6.2 beschrieben, kann das Problem zu lindern. Wenn alle Stricke reißen, Redesign der Primer und versuchen, versuchen Sie es erneut.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> Sigma </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml dünnwandigen Rohre PCR-Röhrchen </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml dünnwandige Deckel </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TE-Puffer: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA Dinatriumsalz Dihydrat </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> Benutzerdefinierte Phage Primer </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> Benutzerdefinierte Phage Primer </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> Benutzerdefinierte Hefe Primer </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> SacI-Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> Benutzerdefinierte Hefe Primer </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> Gal3 (1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> Thermal Cycler </td><td> Bio Rad </td><td> 170-9703 </td><td> Meine Cycler </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel-Elektrophorese </td><td> Hoeffer Scientific Instruments </td><td> Modell HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 kb DNA Ladder </td><td> New England Biolabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> Bio Rad Power Pack </td><td> Bio Rad </td><td> 164-5050 </td><td> Grundlegende PowerPac </td></tr><tr><td> Gel Doc System </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> FOTO / Analyst Investigator FX Workstation </td></tr></tbody></table>

polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies

In der biologischen Wissenschaften gab es technologische Fortschritte, die die Disziplin in goldenen Zeitalter katapultieren Entdeckungsreise. Zum Beispiel wurde das Gebiet der Mikrobiologie mit dem Aufkommen von Anton van Leeuwenhoek das Mikroskop, das die Wissenschaftler zu Prokaryoten zum ersten Mal zu visualisieren erlaubt verwandelt. Die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine jener Innovationen, die den Verlauf der molekularen Wissenschaft mit ihren Auswirkungen Spanning unzählige Teildisziplinen der Biologie verändert. Der theoretische Prozess wurde durch Keppe und Mitarbeitern im Jahr 1971 skizziert, allerdings war es noch 14 Jahre dauern, bis die komplette PCR-Verfahren wurde beschrieben und experimentell angewandt von Kary Mullis, während an der Cetus Corporation im Jahr 1985. Automatisierung und Ausgestaltung dieser Technik weiter mit der Einführung eines thermisch stabile DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus, damit der Name Taq DNA Polymerase. Die PCR ist eine Powerful Amplifikationsverfahren, die eine hohe Verfügbarkeit von einem bestimmten Segment der DNA (dh, ein Amplikon) aus nur eine kleine Menge des Ausgangsmaterials (dh DNA-Matrize oder Zielsequenz) erzeugen kann. Während in der Regel unkompliziert und problemlos, es gibt Fallstricke, die die Reaktion produzieren falsche Ergebnisse erschweren. Wenn es fehlschlägt PCR lässt sich auf viele nicht-spezifische DNA-Produkte in verschiedenen Größen, die als Leiter oder Abstrich von Bands auf Agarosegelen erscheinen führen. Manchmal bilden keine Produkte überhaupt. Ein weiteres potentielles Problem tritt auf, wenn Mutationen unbeabsichtigt in den Amplikons eingeführt werden, was zu einer heterogenen Population von PCR-Produkten. PCR-Ausfälle werden kann frustrierend es sei denn, Geduld und sorgfältige Fehlerbehebung eingesetzt werden, zu klären und lösen das Problem (e). Dieses Protokoll werden die grundlegenden Prinzipien der PCR, eine Methode bereit, die in der Amplifikation der Zielsequenzen meisten führen wird, und präsentiert Strategien zur Optimierung einer Reaktion. Durch Einhalten dieses PCR, STudents sollte in der Lage: <ul><li> Richten Sie Reaktionen und Temperaturwechsel Bedingungen für eine konventionelle PCR-Experiment </li><li> Verstehen Sie die Funktion der verschiedenen Reaktionskomponenten und ihre Gesamtwirkung auf einer PCR-Experiment </li><li> Gestaltung und Optimierung einer PCR-Experiment für jede DNA-Template </li><li> Problembehandlung fehlgeschlagener PCR-Experimente </li></ul>

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Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

PCR hat sich als eine übliche Technik in vielen molekularbiologisch arbeitenden Labors entstanden. Vorausgesetzt ist hier eine Kurzanleitung, um mehrere konventionelle PCR-Protokolle. Da jede Reaktion ist ein einzigartiges Experiment, optimale Voraussetzungen, um ein Produkt liefern zu variieren. Das Verständnis der Variablen in einer Reaktion ermöglicht eine wesentlich bessere Effizienz Fehlerbehebung, wodurch die Möglichkeit, das gewünschte Ergebnis zu erhalten.

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Fehlersuche und Optimierungsstrategien

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

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399.0K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. PCR hat sich als eine übliche Technik in vielen molekularbiologisch arbeitenden Labors entstanden. Vorausgesetzt ist hier eine Kurzanleitung, um mehrere konventionelle PCR-Protokolle. Da jede Reaktion ist ein einzigartiges Experiment, optimale Voraussetzungen, um ein Produkt liefern zu variieren. Das Verständnis der Variablen in einer Reaktion ermöglicht eine wesentlich bessere Effizienz Fehlerbehebung, wodurch die Möglichkeit, das gewünschte Ergebnis zu erhalten.