La vena safena se expone repentinamente a afecciones arteriales después de la cirugía de derivación de la arteria coronaria. Comprender su respuesta de adaptación al estrés mecánico puede ayudar a diseñar herramientas terapéuticas para prevenir el fracaso del injerto venoso. Este protocolo de aislamiento de células endoteliales es muy sencillo y sólo requiere incubación con colagenasa.
Con una manipulación mínima de los vasos, esto reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. El protocolo para aislar los SVEC humanos y cultivarlos bajo esfuerzo cortante y estiramiento cíclico es esencial para comprender la contribución de las fuerzas mecánicas en la disfunción de las células endoteliales asociadas con el fracaso del injerto de vena safena. El cultivo celular endotelial previo es muy exigente en términos de suplementos de medios celulares.
Es obligatorio agregar factores de crecimiento para aislar con éxito un cultivo, los SVEC humanos. Para aislar células endoteliales primarias de la vena safena humana o SVEC humanas, recolecte al menos un segmento de vena safena de dos a tres centímetros de largo. Trabajando bajo una campana de flujo laminar estéril, transfiera el segmento de la vena a una placa de Petri llena de PBS precalentado.
Para eliminar toda la sangre del interior de la luz, inserte una punta de pipeta unida a una pipeta y llénela con PBS en un extremo de la vena y enjuáguela suavemente. Enjuague hasta que el flujo de lavado se aclare por completo. Luego cierre un extremo de la vena con una sutura de algodón estéril.
Llene cuidadosamente el vaso con un miligramo por mililitro de solución de colagenasa tipo 2 y cierre el otro extremo del recipiente con una sutura de algodón. Incubar el recipiente con solución de colagenasa en una atmósfera humidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora. Luego corte un extremo del recipiente sobre un tubo de 15 mililitros para recolectar la solución de colagenasa antes de cortar el otro extremo.
Enjuague la superficie luminal con uno o dos mililitros de PBS para recoger todas las células endoteliales desprendidas dentro del tubo con colagenasa. Centrifugar el tubo a 400 g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en tres o cuatro mililitros de medio celular endotelial completo que contenga una solución adicional de heparina.
Coloque las células en una placa de cultivo celular de 60 milímetros pre-recubierta con 3% de peso por volumen de gelatina. Incubar las células en una atmósfera humidificada durante cuatro días sin cambiar el medio. Después de eso, cambie el medio cada dos días sin agregar la suplementación con heparina.
Examine la placa bajo el microscopio para asegurarse de que se hayan eliminado los glóbulos rojos. Después de uno a cuatro días después de la extracción, dependiendo del tamaño y diámetro del segmento de la vena, visualice los SVEC humanos mediante microscopía de contraste de fase para evaluar el grado de confluencia y su morfología de adoquines. Continúe cambiando los medios cada dos días hasta que las células alcancen el 70% al 80% de confluencia.
Cubra el portaobjetos de la cámara de flujo con 0,1% de peso por volumen de gelatina e incube durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados. Para equilibrar la unidad fluídica y el conjunto de perfusión estéril que tiene depósitos de 10 milímetros, incubarlos durante la noche en una atmósfera humidificada. Para el experimento de esfuerzo cortante, sembrar 200, 000 células endoteliales suspendidas en 100 microlitros de medio de cultivo en el portaobjetos de la cámara de flujo recubierta de gelatina.
Para unir las células a la superficie de cultivo, incubar las células durante cuatro horas. Coloque el conjunto de perfusión en la unidad fluídica. Llene los depósitos y el conjunto de perfusión con aproximadamente 12 mililitros de medio celular endotelial completo precalentado.
Retire las burbujas de aire del conjunto de perfusión para equilibrar el nivel de ambos depósitos a cinco mililitros. Coloque la unidad fluídica en el equipo de perfusión montado sin la corredera de la cámara en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba regulada por computadora. Al ejecutar el protocolo predefinido en el software de control de la bomba, elimine todas las burbujas de aire de los depósitos y del conjunto de perfusión.
Tome la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado en la campana de flujo laminar y fije los portaobjetos que tienen una monocapa de celda de confluencia. Después de colocar toda la unidad con las guías en la incubadora, conecte su cable eléctrico a la bomba. En el software de control de la bomba, ajuste la configuración de la unidad fluídica seleccionando el tipo de portaobjetos y ajustando la viscosidad del medio.
En los parámetros de flujo, introduzca el valor de esfuerzo cortante y establezca la duración del ciclo y el tipo de flujo. A continuación, haga clic en el botón de reproducción para iniciar el experimento. Recuerde mantener el portaobjetos con células tratadas con el mismo medio sin exposición al flujo como controles estáticos.
Aplique lubricante a base de silicona en la parte superior y lateral de la estación de carga equibiaxial de 25 milímetros y 6 pocillos. Semilla 400, 000 células suspendidas en tres mililitros a cada pocillo de las placas de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos recubiertas con colágeno uno. Incubar las células en aire humidificado hasta que alcancen el 100% de confluencia.
Antes de comenzar el protocolo de estiramiento, lave las células una vez con PBS precalentado y agregue tres mililitros de medio de cultivo fresco por pocillo. Inserte la placa base con todas las estaciones de carga lubricadas en la incubadora y conecte adecuadamente el tubo con el equipo controlador del sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión. Fije cada placa de cultivo a una junta roja proporcionada por el sistema de biorreactor.
Luego colóquelos en la placa base en la incubadora. Coloque las cuatro placas de cultivo en la placa base para lograr una carga de vacío y estiramiento adecuada. Encienda el equipo controlador y el sistema informático.
Abra el software de control FlexCell y configure el régimen deseado, incluido el porcentaje de elongación, la forma de onda, la frecuencia y el tiempo. Guarde el régimen. Encienda el sistema de vacío, luego seleccione el régimen y haga clic en iniciar en la pantalla de la computadora para ejecutar el estiramiento.
Compruebe que la membrana de silicona se está moviendo y estirando las células. Las células endoteliales adheridas se podían observar de 4 a 10 días después de la extracción. Inicialmente forman grupos de células que muestran una morfología típica de adoquines.
Expresaron los marcadores CE CD31 y VE-cadherina. Los hSVEC cuando se cultivan bajo tensión de cizallamiento se alinean en la dirección del flujo. El esfuerzo cortante de 20 dinas por centímetro cuadrado durante 72 horas induce la expresión de genes mecanosensibles típicos, KLF2, KLF4 y NOS3, lo que indica la efectividad del estímulo de cizallamiento.
El resultado del estiramiento cíclico dependió de la intensidad aplicada a los SVEC humanos. Las células bajo bajo estiramiento mostraron un patrón cortical de actina F similar a las células estáticas. Sin cambios en la liberación de óxido nítrico durante un máximo de 72 horas, nuestros niveles arteriales de estiramiento remodelaron el citoesqueleto de actina después de 24 horas y disminuyeron la liberación de NO después de 72 horas.
Además de los estudios de estrés mecánico, los investigadores pueden usar las células aisladas para realizar varios métodos para ampliar el conocimiento de la función y disfunción de las células endoteliales. Siguiendo el protocolo demostrado, es posible estudiar cualquier otro tipo de células endoteliales bajo esfuerzo cortante y estiramiento.
