Los autores desean agradecer a Anke Rüttgeroth Zimmermann y Karina de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención NI 1301/1-1 a VON) y la Universidad de Göttingen Medical Center (&quot;pro futura&quot; otorgamiento de VON).

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	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

en este protocolo, se demuestra cómo crear un simple y de bajo costo pero de gran alcance FRET sistema de imágenes para aplicaciones de rutina con una variedad de biosensores disponibles. El sistema que aquí se presenta está diseñado para PPC y YFP, o tipos similares de proteínas fluorescentes, como la pareja donante-aceptor. Mientras tanto, otros biosensores individuales estén disponibles que utilizan por ejemplo las proteínas fluorescentes verdes y rojas 14. Para adaptar el sistema descrito para otr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> BES Buffer Grado </td><td> AppliChem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 dihidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Diámetro 24 mm </td></tr><tr><td> Con fondo de cristal platos de cultivo celular </td><td> World Precision Instruments </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 hexahidratado </td><td> AppliChem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> AppliChem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia invertido </td><td> por ejemplo, Nikon </td><td> Solicitud de Nikon </td><td></td></tr><tr><td> Coolled </td><td> Coolled </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Fotometría </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView filtro regulador </td><td> Fotometría </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP Juego de filtros </td><td> Tecnología Chroma </td><td> 49052 </td><td> sin el filtro de emisión </td></tr><tr><td> ORCA-03G cámara </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino I / O </td><td> Sparkfun Electronics </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor cámara de la célula </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Ordenador personal con sistema Windows XP o Windows 7 </td><td> Cualquier proveedor </td><td></td><td> Incluye unidad de disco duro de alta capacidad </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía continúa ganando creciente interés como una técnica para la monitorización en tiempo real de eventos bioquímicos y de señalización en las células vivas y tejidos. En comparación con los métodos bioquímicos, esta nueva tecnología se caracteriza por una alta resolución temporal y espacial. FRET experimentos utilizar diversos genéticamente codificados con biosensores que pueden ser expresados ​​y la imagen con el tiempo in situ o in vivo 1-2. Biosensores típicos pueden reportar interacciones proteína-proteína mediante la medición de FRET entre un par fluoróforo de etiquetado de proteínas o cambios conformacionales en una única proteína que alberga fluoróforos donante y aceptor interconectados con un resto de unión para una molécula de interés 3-4. Biosensores bimoleculares para las interacciones proteína-proteína incluyen, por ejemplo, construye diseñado para controlar la activación de la proteína G en las células 5, mientras que los sensores unimoleculares meamedida digital cambios conformacionales son ampliamente utilizados para mensajeros segunda imagen tales como calcio 6, cAMP 7-8, fosfatos de inositol 9 y cGMP 10-11. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes individuales de los componentes disponibles en el mercado y cómo controlar la configuración de todo el software gratuito con Micro-Manager. Este instrumento simple pero potente está diseñado para mediciones de rutina o más sofisticado FRET en células vivas. Imágenes obtenidas son procesadas usando auto-escrito plug-ins para visualizar los cambios en la relación de FRET en tiempo real durante todo experimento antes de ser almacenada en un formato de gráficos compatible con la construcción, en ImageJ software gratuito utilizado para el análisis posterior de los datos. Este sistema de bajo costo se caracteriza por una alta flexibilidad y puede ser utilizado con éxito para controlar varios eventos bioquímicos y moléculas de señalización por una plétora de biosensores disponibles FRET en células vivas y tejidos. Como un ejemplo, se demuestra hómo utilizar este sistema de imagen para realizar monitoreo en tiempo real de cAMP en células vivas de 293A a la estimulación con un agonista de los receptores β-adrenérgicos y bloqueantes.

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FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

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23.0K vistas.  Georg August University Medical Center, Göttingen, Germany. Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.