Gli autori desiderano ringraziare Anke Rüttgeroth e Karina Zimmermann per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (sovvenzione NI 1301/1-1 di VON) e Università di Göttingen Medical Center (&quot;pro futura&quot; sovvenzione VON).

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	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

in questo protocollo, abbiamo spiegato come creare un semplice basso costo ma potente FRET sistema di imaging per applicazioni di routine con una varietà di biosensori disponibili. Il sistema presentato è progettato per CFP e YFP, o altri tipi di proteine ​​fluorescenti, come donatore-accettore coppia. Nel frattempo, altri biosensori individuali diventano disponibili che utilizzano per esempio le proteine ​​fluorescenti verdi e rosse 14. Adattare il sistema descritto per altri colori, fonti di luce ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> BES Buffer Grado </td><td> Una tecnologia professionale </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 diidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Diametro 24 mm </td></tr><tr><td> Vetro a fondo di coltura cellulare piatti </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 esaidrato </td><td> Una tecnologia professionale </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Una tecnologia professionale </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Invertito microscopio a fluorescenza </td><td> ad esempio Nikon </td><td> Richiesta di Nikon </td><td></td></tr><tr><td> Coolled </td><td> Coolled </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Fotometrici </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView filtro dispositivo di scorrimento </td><td> Fotometrici </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP filtro set </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 49052 </td><td> senza il filtro per le emissioni </td></tr><tr><td> ORCA-03G fotocamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino scheda I / O </td><td> Sparkfun Elettronica </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor cella camera </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Personal computer con sistema Windows XP o Windows7 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td> Include disco rigido ad alta capacità </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia continua a guadagnare un crescente interesse come tecnica di monitoraggio in tempo reale di eventi biochimici e di segnalazione nelle cellule vive e tessuti. Rispetto ai classici metodi biochimici, questa nuova tecnologia è caratterizzata da elevata risoluzione temporale e spaziale. FRET esperimenti utilizzare vari geneticamente codificati biosensori che possono essere espresse e ripreso nel tempo in situ o in vivo 1-2. Biosensori tipici possono segnalare interazioni proteina-proteina misurando FRET tra una coppia fluoroforo-etichettato di proteine ​​o cambiamenti conformazionali in una singola proteina che porti donatore e accettore fluorofori interconnessi con una parte che lega ad una molecola di interesse 3-4. Biosensori bimolecolari di interazioni proteina-proteina includono, per esempio, costruisce progettato per monitorare G-proteina di attivazione di cellule 5, mentre i sensori unimolecolari meaSuring cambiamenti conformazionali sono ampiamente utilizzati per messaggeri seconda immagine come calcio 6, cAMP 7-8, inositolo fosfati 9 e cGMP 10-11. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da singoli componenti disponibili in commercio e come controllare l&#39;intero setup utilizzando il micro-Manager freeware. Questo strumento semplice ma potente è stato progettato per misurazioni di routine o più sofisticati FRET in cellule vive. Le immagini acquisite vengono elaborate utilizzando auto-scritto plug-in per visualizzare le modifiche in FRET rapporto in tempo reale in un periodo di sperimentazione prima di essere memorizzati in un formato grafico compatibile con il build-in freeware ImageJ utilizzato per la successiva analisi dei dati. Questo sistema a basso costo è caratterizzato da un&#39;elevata flessibilità e può essere utilizzato con successo per monitorare i vari eventi biochimici e molecole di segnalazione da una pletora di biosensori disponibile FRET in cellule vive e tessuti. Come esempio, dimostriamo how utilizzare questo sistema di imaging per eseguire il monitoraggio in tempo reale di cAMP in cellule vive 293A dopo stimolazione con un β-agonista del recettore adrenergico e bloccante.

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FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

fret-microscopy-for-real-time-monitoring-signaling-events-live-cells

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Biology

23.0K Views.  Georg August University Medical Center, Göttingen, Germany. Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.