Les auteurs tiennent à remercier Anke Rüttgeroth et Karina Zimmermann pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvention NI 1301/1-1 à VON) et de l&#39;Université de Göttingen Medical Center («pro futura&quot; subvention à VON).

<ol>
	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

dans ce protocole, nous montrons comment construire un système d&#39;imagerie simple et peu coûteuse mais puissante FRET pour les applications de routine avec une variété de biocapteurs disponibles. Le système présenté ici est conçu pour les CFP et YFP ou des types similaires de protéines fluorescentes, comme la paire donneur-accepteur. Pendant ce temps, d&#39;autres biocapteurs individuels sont disponibles qui utilisent par exemple vert et rouge protéines fluorescentes 14. Pour adapter le système ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> BES tampon année </td><td> APPLICHEM </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 dihydrate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslides verre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Diamètre 24 mm </td></tr><tr><td> À fond de verre en culture cellulaire plats </td><td> World Precision Instruments </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM moyen </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 hexahydraté </td><td> APPLICHEM </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> APPLICHEM </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Inverted microscope à fluorescence </td><td> par exemple Nikon </td><td> Demande de chez Nikon </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Photométrie </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView filtre curseur </td><td> Photométrie </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP jeu de filtres </td><td> Technologie Chroma </td><td> 49052 </td><td> sans le filtre d&#39;émission </td></tr><tr><td> ORCA-03G caméra </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino I / O </td><td> Sparkfun Electronics </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Chambre de cellule Attofluor </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Ordinateur personnel avec système Windows XP ou Windows 7 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td> Inclure disque dur de grande capacité </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie continue de gagner un intérêt croissant en tant que technique de suivi en temps réel des événements biochimiques et de signalisation dans les cellules vivantes et les tissus. Par rapport aux méthodes classiques biochimiques, cette nouvelle technologie est caractérisée par la résolution temporelle et spatiale. Expériences de FRET utiliser différents génétiquement codés biocapteurs qui peuvent être exprimées et imagée au fil du temps in situ ou in vivo 1-2. Biocapteurs typiques peuvent signaler supporte interactions protéine-protéine par mesure de FRET entre une paire fluorophore marqué de protéines ou de changements conformationnels de la protéine unique qui abrite donneur et fluorophores accepteurs reliés entre eux par un groupement de liaison pour une molécule d&#39;intérêt 3-4. Biocapteurs pour bimoléculaires interactions protéine-protéine, par exemple, construit conçu pour surveiller la protéine G d&#39;activation dans les cellules 5, tandis que les capteurs unimoléculaires meaSuring changements conformationnels sont largement utilisés pour des messagers de la seconde image tels que le calcium 6, AMPc 7-8, inositol phosphates 9 et cGMP 10-11. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d&#39;imagerie à partir de simples composants disponibles dans le commerce et la façon de contrôler l&#39;ensemble de l&#39;installation en utilisant le logiciel gratuit Micro-Manager. Cet instrument simple mais puissant est conçu pour des mesures de routine ou plus sophistiquées FRET dans des cellules vivantes. Les images acquises sont traitées à l&#39;aide d&#39;auto-écrite plug-ins de visualiser les changements dans les taux de FRET en temps réel au cours des expériences avant d&#39;être stockées dans un format graphique compatible avec le build-in freeware ImageJ utilisé pour l&#39;analyse ultérieure des données. Ce système à faible coût se caractérise par une grande flexibilité et peut être utilisé avec succès pour contrôler divers événements biochimiques et des molécules de signalisation par une pléthore de biocapteurs disponibles FRET dans des cellules vivantes et des tissus. A titre d&#39;exemple, nous démontrons homment utiliser ce système d&#39;imagerie pour effectuer un suivi en temps réel de l&#39;AMPc dans des cellules vivantes 293A lors de la stimulation avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques et bloqueur.

Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie est une technique puissante pour surveiller en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant différents biocapteurs en tant que journalistes. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d&#39;imagerie à partir de composants disponibles dans le commerce et la façon de l&#39;utiliser pour des expériences de FRET.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

fret-microscopy-for-real-time-monitoring-signaling-events-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K vues.  Georg August University Medical Center, Göttingen, Germany. Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie est une technique puissante pour surveiller en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant différents biocapteurs en tant que journalistes. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de composants disponibles dans le commerce et la façon de l'utiliser pour des expériences de FRET.