Los autores desean agradecer al Dr. Zachary Z. Brown y Jennifer Alleva para el desarrollo inicial de esta técnica de síntesis en fase sólida y Matthew Parker FL útil para los debates. Este trabajo es apoyado por la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) y el Premio Horst Witzel Beca financiada por Cephalon, Inc.

1. El programa de instalación <ol><li> La reacción puesta a punto para la síntesis en fase sólida es un cartucho de filtro de polipropileno o reactor de vidrio que está conectado a través de tubos de polipropileno a un matraz cerrado filtrado bajo vacío como se muestra en la Figura 1. La reacción se puede mezclar por una barra de agitación magnética o haciendo burbujear nitrógeno a través del reactor. </li><li> Un colector de gas conectado a un cilindro de argón equipado con un tubo de secado y borboteador de aceite también se recomienda ya que permite al recipiente de reacción para ser contenida en una atmósfera inerte y permite la eliminación de los reactivos de recipientes herméticos. </li><li> Todas las operaciones se llevan a cabo en una campana de humos y equipo de protección personal (anteojos de seguridad, bata de laboratorio y guantes de nitrilo) se requiere. </li></ol> 2. Cargando Primero Bis-péptido en la resina <ol><li> Pesar 114 mg de HMBA-AM Resina (0,88 mmol / g de carga, 100 mmol) en 8 ml recipiente de reacción y añadir la barra de agitación magnética. Tapar la parte superior de THe vasija con un tabique de caucho y el tubo de purga con argón durante al menos 5 minutos. </li><li> Mientras tanto, pesan 117,3 mg del compuesto 1 de la Figura 3 (586,63 g / mol, 2eq) y 59,2 mg de 1 - (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) en un tubo de centrífuga de 15 ml desechable y disolver en 2 ml de diclorometano anhidro (DCM). Añadir 24 l de 1-metilimidazol (NMI, 80,81 ml / mol, 3eq) a la solución y se mezcla hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Transferir la solución activada al recipiente de reacción mediante una jeringa y permita que se agita bajo argón durante la noche (aproximadamente 10 horas). </li><li> Quitar el tabique y drenar la mezcla de reacción. Lavar la resina con DCM (5x) y dimetilformamida (DMF) (5x). Lleve a cabo el &quot;metil rojo de prueba&quot; que se describe en la sección 10.1 para evaluar el grado de carga de la resina. Si la resina permanece en rojo durante la prueba de rojo de metilo a continuación los pasos 2.2 y 2.3 se debe repetir. Un color amarillo, indicativo de un grupo metilo negativo en la prueba de color rojo, se prefiere;Sin embargo, puesto que ningún grupo hidroxilo restantes se limitará en la siguiente etapa, un resultado ligeramente positivo (color de la luz resina naranja) puede ser aceptable. </li></ol> 3. La desprotección de primera resina Bis-péptido y simultánea de límite <ol><li> Añadir 1 ml de DCM a la vasija de reacción a continuación, añadir 1 ml 33% gota a gota bromuro de hidrógeno en ácido acético durante 30 segundos (burbujeo se produce) y permitir a agitar durante 15 minutos. Escurrir y lavar la resina con DCM (5x) y luego repetir procesar una vez más. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). Neutralizar la resina por lavado dos veces con un 5% v / v de solución de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) en DMF a continuación, se lava con DCM (5x) y DMF (5x) de nuevo. Realizar la &quot;prueba de rojo de metilo&quot; y &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en las secciones 10.1 y 10.2. Los resultados deben ser negativos para el rojo de metilo prueba y positivo para la prueba de cloranil. </li></ol> 4. Acoplamiento Boc / tBu-Protegido funcionalizados Bis-Amisin ácido <ol><li> Reintroducir una atmósfera inerte a la resina que contiene recipiente de reacción por lavado tres veces con DCM anhidro después coloque un tabique y la línea de argón. Purgar y lavar el recipiente mediante la adición de 1-2 ml de DCM anhidro y dejar que se agita durante 30 segundos y luego vaciar el recipiente hasta que el argón línea de burbujeo empieza a subir. ¿Es esto por lo menos una vez más. </li><li> Preparar una solución de 0,15 M funcionalizado bis-aminoácido (3eq) y 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) en 2 mL de 2:1 DCM: DMF en una prueba de secado a la llama tubo bajo atmósfera de argón. Añadir 47 l de diisopropilcarbodiimida (DIC, 156,6 ml / mol, 3eq) y se agita durante 90 minutos. </li><li> Añadir 35 l DIPEA (174,19 ml / mol, 2eq) en DMF anhidra 666 l de resina y permita que se agita durante 5 minutos. </li><li> Transferir la pre-activado bis-amino solución de ácido al recipiente de reacción mediante una jeringa y permita que se agita durante la noche. </li><li> Escurrir la mezcla de reacción y se lava dos veces con DCM anhidro mientras que bajo<html> argón. </li><li> Para promover el cierre de la dicetopiperazina, añadir una solución 0,25 M de HOAt (136,11 g / mol, 10eq) y DIC (156,6 ml / mol, 10eq) en un ml 4 de 1:1 DCM: DMF y permitir a agitar en atmósfera de argón durante 1 hora. </li><li> Quitar el tabique y drenar la mezcla de reacción. Lavar la resina con DCM (5x) y DMF (5x). Si lo desea, realice la &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en la sección 10.2. </li></ol> 5. La desprotección de Boc / tBu-Protegido funcionalizados Bis-aminoácido <ol><li> Añadir 2 ml de una solución de ácido 95:5 trifluororacetic (TFA): triisopropilsilano (TIPS) al recipiente de reacción y permitir que se agita durante 1 hora. Escurrir y lavar la resina durante unos 30 segundos con DCM (5x) y luego repita el proceso una vez más. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). Neutralizar la resina por lavado dos veces con un 5% v / v de solución de DIPEA en DMF lavar DCM (5x) y DMF (5x) de nuevo. Si lo desea, realice la &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en la sección 10.2. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Repita los pasos 4 y 5 como se desee para sintetizar dirigido bis-péptido. 7. El fin de funcionalización Prolidine Bis-péptido <ol><li> El extremo prolidine de la creciente bis-péptido puede ser acilado independientemente o conjuntamente a través de una dicetopiperazina. Además, este fin se puede dejar protegido, que se escinde último, proporcionando el aminoácido libre. Si lo desea, realice la &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en la sección 10.2 para evaluar la eficiencia de acoplamiento. </li></ol> 8. La desprotección de Fmoc y acilación de la finalización del Cuaternario de la bis-Péptido <ol><li> Una solución 2 ml de 20% de piperidina en DMF se añade y la mezcla de reacción se durante 20 minutos. Escurrir y lavar la resina con DMF (5x) y luego repita el proceso una vez más. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). </li><li> Preparar una solución 0,15 M de ácido amino (3eq) en 2 ml de N-metilpirrolidona (NMP) con 114 mg de 2 - (7-aza-1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) y 104,5 l DIPEA (174,19 ml / mol, 6EQ) y mezclar bien. Añadir al recipiente de reacción y permitir en agitación durante 6 horas. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). </li></ol> 9. Eliminar el grupo Boc desde unido a la resina de aminoácidos y se unirá a partir de Resina <ol><li> Añadir 2 ml de una TFA 1:1: solución de DCM al recipiente de reacción y permitir en agitación durante 30 minutos. Escurrir y lavar la resina con DCM (5x) y luego repetir procesar una vez más. </li><li> Lavar y escurrir la resina durante 30 segundos con DCM (5x) y luego DMF (5x). </li><li> Añadir 2 ml de una solución de 10% DIPEA en DMF anhidro y permitir a agitar 24-48 horas. </li><li> Recoger mezcla de reacción en previamente pesado matraz de fondo redondo. Transferir 30 l de esta solución a 450 l de THF en un frasco de LC-MS y presentar para su análisis. Lavar la resina con alícuotas adicionales de DMF y se recogen en el matraz de fondo redondo entonces eliminar el disolvente a vacío. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purificación de Bis-Péptido <ol><li> Disolver crudo bis-péptido en una cantidad mínima de dimetilsulfóxido (100-250 l) y la transferencia en inserto vial de HPLC. Coloque el inserto en el muestreador automático de semi-prepitive sistema de HPLC (Hewlett Packard 1100 Series) equipado con un XTerra Prep MS C18 columna de 5 m mm 7.8x150 y un circuito de inyección de 100 l. </li><li> Realizar múltiples inyecciones de 50 l de la muestra utilizando un programa de gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos mientras se monitoriza a 274 nm. Recoger el pico del producto en un tubo de centrífuga previamente pesado disponible y congelar en seco utilizando un liofilizador. Se debe tener precaución con la carrera por primera vez como un ligero cambio en el tiempo de retención de pico en comparación con el LCMS de análisis se observa típicamente. </li></ol> 11. Métodos de evaluación <ol><li> Rojo de metilo PRUEBA 7: Retire aproximadamente 1 mg de la resina seca a través de una pipeta desechable y enjuague en 4 ml recipiente de reacción. Añadir una solución de 20 mg de rojo de metilo, 50 N l, N&#39;-diisopropilcarbodiimida (DIC), y 5 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en 500 l DCM anhidro y permita que se agita durante 5-10 minutos. Escurrir y lavar la resina con DCM hasta que el filtrado se vuelve incolora. Indicación positiva es las perlas de resina restantes naranja o rojo. </li><li> PRUEBA cloranil 12: Transferencia de ~ 1 mg de resina seca en un frasco pequeño a través de una pipeta desechable. Añadir 3 gotas de tanto un cloranilo 0,8 mM en solución de DMF y 2% de acetaldehído en solución de DMF y deje reposar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Indicación positiva es las perlas de resina de inflexión azul / morado. </li><li> Test de activación de TRAP: compuestos activados durante la síntesis se puede evaluar mediante la transferencia de una pequeña cantidad (l 5-10) de la solución activada a una cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) frasco que contiene 50 l de pirrolidina. Mezclar con la mano durante unos segundos (solucidebe convertirse en amarillo) y luego se diluye con 450 l de tetrahidrofurano (THF) y someter a análisis de LC-MS. </li><li> ANALÍTICA LC-MS: El producto final y los intermedios activados se puede evaluar utilizando una HP 1200 serie LC-MS sistema equipado con un Waters Xterra MS C18 3,5 m 4,6 mm x 150 mm de columna y un sistema de gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos. </li></ol> 12. Los resultados representativos Un ejemplo de ambos crudo (Figura 4) y purificado (Figura 5) trazas LCMS se proporcionan. Purificadas de los rendimientos de aproximadamente el 10% se espera que mediante los métodos descritos anteriormente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama del montaje experimental para la síntesis en fase sólida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figura 2.Nomenclatura pertinente de Bis-Aminoácidos Péptidos / Bis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema sintético general. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figura 4a. Traza de HPLC del producto crudo a 274 nm. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figura 4b. Espectro MS del pico de producto bruto. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figura 5a. HPLC de seguimiento de producto purificado a 274 nm. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figura 5b. MS Espectro de Produc purificadat pico.

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No hay conflictos de interés declarado.

El enfoque sintético presenta en este documento proporciona un método para la síntesis de péptidos funcionalizados bis-bis-a partir de unidades de aminoácidos utilizando comunes en fase sólida técnicas de síntesis de péptidos. La síntesis de monómeros de estos bloques de construcción &quot;Pro4&quot; de trans-4-hidroxiprolina 3 es altamente escalable y se ha completado con éxito a la etapa de hidantoína en un 600 mmol (234 g) de escala (no publicado). Una vez que los monómeros están en la mano, el uso de técnicas en fase sólida proporciona un método más rápido de bis-péptido de síntesis que nuestro actual en fase de solución metodología 4, eliminando la necesidad de reacción de trabajo en marcha y purificaciones intermedias. El principal desafío en la síntesis en fase sólida es el diagnóstico de los avances sintético y la resolución de problemas ya que no hay intermediarios están aislados. Esto ha llevado al desarrollo de muchos ensayos colorimétricos incluyendo aquellos para identificar si aminas libres (Kaiser Prueba 10) o Hydrox libreHMJM (metil rojo de prueba 7) se exponen en la resina. Desafortunadamente, el uso común de prueba Kaiser 10 no es aplicable en general en nuestra síntesis en fase sólida, debido al uso casi exclusivo de aminas secundarias o aminas unidas a un carbono cuaternario. Otras opciones para la evaluación en resina HMBA incluyen divisiones de prueba usando un nucleófilo tal como hidrazina 11, escisión cuantitativa Fmoc seguimiento por UV / Vis 1,11, y la captura y el análisis de entrantes compuestos activados. Otra cuestión vecinos en síntesis en fase sólida es la naturaleza repetitiva de etapas sintéticas requeridos por el operador. Con esto en mente, los autores recomiendan el uso de una hoja de cálculo o lista de control al realizar cualquier manual de síntesis en fase sólida de péptidos. La dificultad en el uso de bis-péptidos para síntesis en fase sólida en comparación con comunes α-aminoácidos incluye la posibilidad de acoplamientos más difícil debido a estérico HinDrance, la necesidad de cierres de dicetopiperazina en resina, y desprotecciones simultáneas (Boc / tBu; Cbz / tBu). Otra dificultad radica en conseguir la liberación cuantitativa de la resina usando este &quot;cierre de seguridad&quot; método en comparación con medios más convencionales. Con estos factores en mente, es muy posible que una mayor optimización de este método se puede lograr y los esfuerzos actuales están llevando a cabo en nuestro grupo para mejorar el método que aquí se presenta.

<table border="1"><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resina </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Cancerígeno </td></tr><tr><td> DCM anhidro </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Cancerígeno </td></tr><tr><td> 33% de bromuro de hidrógeno en ácido acético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Corr. tóxico,osive, humos cuando está abierto </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Inflamable, tóxico </td></tr><tr><td> DMF anhidra </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Inflamable, tóxico </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> CONSEJOS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Inflamable, tóxico </td></tr><tr><td> Piperidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> Rojo de metilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Inflamable, tóxico peróxido, Formación </td></tr><tr><td> Pirrolidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Pescador </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS Los reactores </td><td> Gracia </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> Serie 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Serie 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotavapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argón </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

En 1962, RB Merrifield publicado el primer procedimiento utilizando síntesis en fase sólida de péptidos como una nueva ruta para sintetizar péptidos eficientemente. Esta técnica demostró rápidamente una ventaja respecto a su antecesor en fase de solución en el tiempo y la mano de obra. Las mejoras sobre la naturaleza del soporte sólido, los grupos protectores empleados y los métodos de acoplamiento utilizados en los últimos cinco años sólo han aumentado la utilidad de sistema original de Merrifield. Hoy en día, el uso de una protección Boc-basado y la base / nucleófilo estrategia de resina de escindible o Fmoc basada en la protección y la estrategia de resina ácida escindible, por primera vez por RC Sheppard, son los más utilizados para la síntesis de péptidos 1. Inspirados en sólida de Merrifield estrategia apoyado, hemos desarrollado un Boc / terc-butilo en fase sólida estrategia de síntesis para el montaje de funcionalizados bis-péptidos 2, que se describe en este documento. El uso de síntesis en fase sólida en comparación to en fase de solución metodología no es sólo ventajoso en tanto tiempo y trabajo como se describe por Merrifield 1, sino que también permite una mayor facilidad en la síntesis de bis-péptido bibliotecas. La síntesis que se demuestra aquí incorpora una etapa de escisión final que utiliza una de dos pasos &quot;cierre de seguridad&quot; mecanismo para liberar el funcionalizado bis-péptido de la resina por la formación de dicetopiperazina. Bis-péptidos son rígidos, espiro-escalera oligómeros de bis-aminoácidos que son capaces de posicionar la funcionalidad de una manera predecible y diseñable, controlada por el tipo y la estereoquímica de las unidades monoméricas y la conectividad entre cada monómero. Cada ácido bis-amino es un estereoquímicamente puros, cíclico andamio que contiene dos aminoácidos (un ácido carboxílico con una α-amina) 3,4. Nuestro laboratorio está investigando el potencial de los péptidos funcionales bis-a través de una amplia variedad de campos incluyendo la catálisis, interacciones proteína-proteína y nanomaterials.

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

El eficiente síntesis en fase sólida de péptidos de un funcionalizado bis-péptido trímero utilizando un &quot;cierre de seguridad&quot; procedimiento de escisión de la resina HMBA se describe.

Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de &quot;Cierre de seguridad&quot; Metodología

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K vistas.  Temple University. El eficiente síntesis en fase sólida de péptidos de un funcionalizado bis-péptido trímero utilizando un "cierre de seguridad" procedimiento de escisión de la resina HMBA se describe.

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Optimización de la reacción de Ugi mediante la síntesis en paralelo y manejo de líquidos automatizados

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Investigación

Biología

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2&#039;-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...