Este protocolo utiliza un método reciclable y modificado en la producción de compuestos espirocíclicos. El ensayo MTT ayuda a responder la pregunta relacionada con la citotoxicidad de estas nuevas moléculas. Esta técnica produce nuevas moléculas modificables utilizando un material de partida regenerador.
El ensayo MTT proporciona resultados biológicos relativamente rápidos y fáciles de analizar Comience realizando la síntesis en fase sólida de los ciclos hetero espirocíclicos seis y siete, como se demostró anteriormente. Prepare 20 mililitros de una solución MTT de cinco miligramos por mililitro utilizando PBS estéril como diluyente. Filtre y almacene la solución a menos 20 grados centígrados.
Luego, prepare una dilución uno a uno de la solución MTT en DMEM. Prepare un mililitro de soluciones madre en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros de compuestos de prueba en DMSO. Guárdelos a menos 20 grados centígrados.
Preparar 200 microlitros por dosis de las soluciones de trabajo de los compuestos problema diluyendo las concentraciones madre. Uno a 1000 en medio libre de suero. En las semillas de cultivo de tejidos, COS siete células en medio completo sobre cultivo de tejido de fondo plano trataron 96 placas de pocillos a una concentración de 4, 000 células por 200 microlitros por pocillo.
Utilizando un pipeter multicanal. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, aspire el sobrenadante de los pozos con una pipeta de vidrio para pasto conectada a una bomba de vacío.
Dosificar las células por triplicado con los compuestos problema utilizando las soluciones de trabajo previamente preparadas. Luego devuelva las células a la incubadora. Después de 24 horas, aspire el sobrenadante de los pocillos y agregue 200 microlitros de solución MTT a cada pocillo.
Incubar el plato durante cuatro horas. Aspirar suavemente el sobrenadante de los pocillos sin alterar los cristales de formazane púrpura. Agregue 200 microlitros de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales.
Luego incubar el plato a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mida la absorbancia de cada pocillo a 590 o 600 nanómetros utilizando un lector de placas de 96 pocillos. Utilice pocillos sin celdas como fondo y promedie el valor de absorbancia.
Las costuras espirocíclicas seis y siete de gox se sintetizaron utilizando un protocolo modificado. El progreso de la reacción fue monitoreado mediante la detección de la desaparición de la alfa beta insaturada Esther mediante espectroscopia infrarroja. El ensayo MTT se utilizó para determinar la viabilidad celular.
El cisplatino, que se sabe que induce la muerte celular a altas concentraciones, sirvió como un control positivo. Como era de esperar, cuanto mayor es la concentración de cisplatino, menor es la viabilidad celular. El ensayo MTT se utilizó para probar los compuestos espirocíclicos seis y siete y furfurilamina.
La furfurilamina y la costura espirocíclica del gox seis mostraron una citotoxicidad similar. Sin embargo, la toxicidad del compuesto espirocíclico siete fue notablemente mayor que la de furfurilamina y seis. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que se encontró que la N-alquilación realizada con haluros de acilo voluminosos reduce la tasa de eliminación beta, lo que reduce el rendimiento del producto.
