Los autores desean agradecer al personal PXRR al NSLS (Brookhaven National Laboratory) para la asistencia durante la recolección de datos y Pillon Mónica para ayuda en la purificación del ADN. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (RP 67189).

1. Purificación de proteínas El enlazador flexible que une el. N-(oligomerización) y C-terminal (de unión a ADN) dominios de SEQA SIDA el reconocimiento de hemimethylated repite GATC separados por uno a tres vueltas en el ADN Para este estudio, se utilizó una variante dimérica de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) con una mutación puntual en el dominio N-terminal que impide aún más la oligomerización y un enlazador acortado que restringe la unión al ADN en tándem para GATC repite separados exclusivamente por una vuelta en el ADN (Figura 1) 2,8. <ol><li> Transformar BL21 (DE3) células con el plásmido que codifica SEQA bajo el control del promotor T7, </li><li> Placa de la reacción de transformación en placas de agar LB-incluyendo 100 mg / ml de ampicilina, </li><li> Recoger colonias mixtas para inocular un cultivo durante la noche a pequeña escala (medio LB con 100 mg / ml de ampicilina), </li><li> A la mañana siguiente inocular un 1 L de medios de comunicación usando una dilución 1:100 de la overnight cultura, </li><li> Cultivar las células hasta una DO 600 de 0,7 ~ e inducir la producción de proteínas por adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM, </li><li> Continuar la incubación durante 3 horas a 37 ° C con agitación orbital y entonces recoger las células por centrifugación (10 min a 3.300 g), </li><li> Resuspender el sedimento celular en tampón de purificación A y lisar por sonicación, </li><li> Borrar el lisado por centrifugación (40 min a 39.000 g) y cargar el sobrenadante en una columna de heparina equilibrada con tampón de purificación, </li><li> SEQA Elute utilizando un gradiente lineal de NaCl 1 M (SEQA eluye a ~ NaCl 0,7 M), </li><li> Piscina las fracciones que contienen SEQA juntos, se diluye para disminuir la fuerza iónica de la muestra y de la carga en una columna de cromatografía de intercambio catiónico equilibrada con tampón de purificación, </li><li> Utilizando un gradiente lineal de sal, puro SEQA eluye a ~ NaCl 0,4 M, </li><li> Piscina las fracciones que contienen SEQA juntos, concentrane (3 mg / ml) y almacenar en tampón de almacenamiento. </li></ol> 2. Purificación de ADN <ol><li> Solicitar oligonucleótidos complementarios unmethylated metilado y de su compañía favorita, </li><li> Se disuelve 1 mol de cada cadena de ADN único liofilizado en 800 l de autoclave ddH 2 O, vórtice y dejar que repose durante 10-20 min, </li><li> Añadir 800 l de tampón de carga 2X precalentado a cada oligonucleótido, </li><li> Para oligonucleótidos 20-30 nucleótidos de largo, preparar una gran gel desnaturalizante 10% (160 x 250 x 1 mm): * Mezclar bien 80 ml de la mezcla PÁGINA 10%, 80 l TEMED y 800 l por persulfato de amonio gel y verter, * Una vez polimerizado, retire el peine y lave los pocillos con fondo ddH 2 O, * Reúne los geles de reparto gel incluyendo placa de enfriamiento y luego llenar los depósitos superior e inferior con tampón de corrida (1X TBE), * Pre-correr el gel a 700-750 V para calentar el gel hasta 55 ° C, * Detener la carrera y enjuague el thoro pozosughly con tampón de corrida. </li><li> Calentar los oligonucleótidos a 90 º C durante 2 min, </li><li> Vortex y centrifugar las muestras e inmediatamente antes de cargar el gel, </li><li> Correr el gel a 700 V ~ y detenerlo una vez que su oligonucleótido se ha desplazado hasta la mitad. (Tenga en cuenta que en un gel de poliacrilamida al 10% de azul de bromofenol co-migra con oligonucleótidos ~ 20 bases de largo y xileno cianol FF con ~ 60 bases de largo), </li><li> Detener el gel, se desmonte de la caja de gel y retirar los separadores, </li><li> En una superficie plana, retire una placa de vidrio y cubrir el gel con una envoltura de plástico, </li><li> Gire el gel alrededor, retire la placa de vidrio otra y se cubre con una envoltura de plástico, </li><li> Marque las bandas con luz UV y una placa fluorescente detrás del gel para ver la sombra de ADN, </li><li> Cortar la banda con una cuchilla de afeitar en trozos pequeños y los transfieren a un tubo estéril de 15 ml, </li><li> Añadir 9 ml de tampón de elución y eluir durante la noche a 37 ° C con agitación, </li><li> Transferir cuidadosamente la solucióna un tubo de centrífuga esterilizado en autoclave usando una pipeta de punta de carga de gel para evitar la transferencia de piezas de acrilamida y añadir 1 ml de acetato de sodio 3 M a pH 7 (dilución 1:10) y 25 ml de etanol enfriado 100% (2,5 volúmenes), </li><li> Incubar a -20 º C durante al menos 3 h, se </li><li> Decantar el sobrenadante y transferir a un tubo separado, </li><li> Secar el pellet de la velocidad-vac a fuego medio, </li><li> Resuspender el pellet en 400 l de autoclave ddH 2 O y transferir a un tubo nuevo, </li><li> Añadir 40 l de acetato de sodio 3 M a pH 7 y 1 ml de etanol al 100%, mezclar bien (vórtice) e incubar 30 min a temperatura ambiente, seguido por 30 min a -20 ° C, </li><li> Girar durante 15 minutos a 18.000 g y descartar el sobrenadante, </li><li> Enjuague el precipitado con 100 l de etanol al 70% frío para eliminar la sal residual del sedimento y centrifugado durante 6 min a 18.000 g. Deseche el etanol y secar el pellet de la velocidad-vac, </li><li> Resuspender el precipitado en un total de 100 l de autoclave ddH <sub&gt; 2 O. Medir la concentración del oligonucleótido, </li><li> Para reasociar los dúplex de ADN hemimethylated, mezclar concentraciones equimolares de las cadenas simples complementarias y calentar las mezclas a 95 ° C en un baño de agua durante 5 minutos y después se dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente en el interior del baño de agua. </li></ol> 3. Proteína-ADN formación de complejos y Análisis <ol><li> Mezclar volúmenes iguales de SeqAΔ purificado (41-59)-A25 (81 mM) y ADN hemimetilado (81 mM), </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 15 min y se almacena a 4 º C hasta que esté listo para usarlo, </li><li> Pantalla de condiciones de cristalización utilizando escaso comerciales de matriz pantallas, </li><li> Una vez pistas iniciales de cristalización se han identificado, optimizar las condiciones para hacer crecer cristales de difracción de calidad, </li><li> Cryoprotect los resultantes de ADN SEQA-cristales, ya sea aumentando la cantidad de PEG 400 presente en la solución de cristalización a una concentración final de 25% (v / v) o la adición de glicerol al 20% (v / v) a la solución de cristalización, </li><li> Recoger los cristales individuales con un lazo de nylon, y los flash-congelar en nitrógeno líquido, </li><li> Pruebe el límite de difracción de cada cristal a 100 K. </li></ol> 4. Los resultados representativos Para obtener la estructura cristalina de SeqAΔ (41-59)-A25R unido al ADN hemimetilado, que consecutivamente tres parámetros optimizados en el ADN: (i) la separación entre hemimethylated secuencias GATC, (ii) la longitud del dúplex, y la (iii) ausencia / presencia de salientes 5 &#39;. Electro-ensayos de cambio de movilidad indican que SeqAΔ (41-59)-A25R se une preferentemente a repeticiones GATC separadas por 9-10 pares de bases (Figura 1). Por lo tanto, inicialmente proyectado dúplex 23-24 pares de bases (pb) de largo que contiene dos secuencias GATC hemimethylated separados por 9 o 10 puntos básicos. Tres dúplex produjo cristales bien formados (Figura 2). Alaunque ninguno de los cristales de difracción de alta resolución, el 23 bps largo dúplex con los dos sitios GATC separadas por 9 bps rayos X difractados mejor que el resto, lo que indica que una separación GATC de 9 bps se prefirió para la cristalización. Por lo tanto, se fijó la distancia entre GATC a 9 puntos básicos para todas las pantallas posteriores. En general, la cristalización se ve favorecida por ADN dúplex correspondientes a longitudes exactas vueltas helicoidales porque múltiples moléculas de ADN pueden apilar de cabeza a cola para formar un continuo B-DNA dentro del cristal 9. Por lo tanto, se acorta la longitud total de los dúplex a 21 bps (es decir, dos vueltas helicoidales). Mientras que un dúplex 21 bps con extremos romos no dió cristales de difracción de calidad (datos no mostrados), un dúplex 21 bps con un solo saliente 5 &#39;de nucleótidos en cada extremo que dió cristales difractan a 5 A en nuestros fuente de origen. La mejora en el límite de difracción sugerido que de extremo a extremo dúplex asociación fue en efecto favorecerING cristal de embalaje. Desde SEQA interactúa con secuencias GATC que están en la misma cara del ADN, la cara opuesta del ADN dúplex debe estar expuesto al disolvente. Para mejorar aún más los cristales del complejo, que modifica entonces la secuencia de los dúplex para incluir un dinucleótido CG entre los dos sitios GATC para promover la cadena principal de ranura interacciones con moléculas de ADN adyacentes en el cristal a través de la cara opuesta de la doble hélice, un método que se ha utilizado para mejorar la cristalización del ADN en el pasado 10. Sin embargo, el límite de difracción de los cristales crecidos con el dúplex que contiene CG era idéntica a las cultivadas con un dúplex de ADN similares que no contienen el dinucleótido CG (Figura 3). Este resultado indica que la cadena principal de ranura interacciones no fueron importantes en este caso. Estamos posteriormente optimizado la longitud de los salientes mediante la comparación de los cristales crecidos con un dúplex de ADN que tenía dos nucleótidos adicionales en cadaExtremo 5 &#39;. Este cambio tuvo un efecto drástico en la morfología del cristal, así como, límite de difracción adicional que indica que el nucleótido cambiado drásticamente los contactos moleculares y organización cristalina mejorada (Figura 3). La estructura cristalina de SeqAΔ (41-59)-A25R unido a esta última dúplex de ADN confirmó que la cara libre de la doble hélice de ADN no participa en contactos de cristal, como el esperado del efecto limitado de la introducción de un dinucleótido CG-. A pesar del tamaño relativo de las proteínas y el ADN, la mayoría de las interacciones entre los compañeros de simetría están mediadas por interacciones proteína-proteína y proteína-DNA-(Figura 4). Curiosamente, en este caso particular, el efecto beneficioso de un voladizo dinucleótido 5 &#39;no es debido a la formación de un ADN de pseudo-continuo. En cambio, el extremo 5 &#39;de los proyectos de cadena metilada de distancia de los ejes del ADN e interacciona con la molécula SEQA proximal del complejo, que explica por qué dos nucleótidos w<html> ere estrictamente necesario para cambiar el cristal embalaje 8,11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> Figura 1. La unión de SeqAΔ (41-59)-A25R a hemimethylated ADN. (A) Representación esquemática de los dominios de oligomerización SEQA que median la proteína y unión de ADN. (B) la movilidad electroforética cambio de ensayo de SeqAΔ (41-59)-A25R con los ADN que contienen dos secuencias GATC hemimethylated separados por un número cada vez mayor de pares de bases ( X). El carril de más a la izquierda (con la etiqueta en blanco) contiene una mezcla equimolar de los ADN con 5, 7, 12, 21, 25 y 34 pares de bases entre las dos secuencias GATC en ausencia de SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) Diagrama que representa las tres variables optimizados en los dúplex de ADN para obtener cristales de difracción de calidad. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Efecto de la variación de la distancia inter-GATC. Resumen de los oligonucleótidos utilizados y los cristales obtenidos con 23-24 pb de largo dúplex que contienen dos sitios GATC hemimethylated separadas por 9 o 10 pares de bases. Todas las imágenes de los cristales fueron tomadas con el mismo aumento y la barra de escala indica 100 micras. El límite de resolución de cada SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA cristal se basa en imágenes de difracción recogidos en un Rigaku RU-300 sistema de generador de rayos-X. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> Figura 3. Efecto de la variación de los extremos de ADN. Resumen de tél oligonucleótidos utilizados y obtenidos cristales con 21 dúplex bps largos que contiene dos sitios GATC hemimethylated separadas por 9 pares de bases e incluyendo 0, 1 o 2 nucleótidos salientes 5 &#39;finales. Todas las imágenes de los cristales fueron tomadas con el mismo aumento y la barra de escala indica 100 micras. El límite de resolución de cada SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA cristal se basa en imágenes de difracción recogidos en líneas de luz y X12C X29 (NSLS, BNL). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> Figura 4. Embalaje de cristal de SeqAΔ (41-59)-A25R unido al ADN con saliente dinucleótido: Visto desde la parte superior (A) y lateral (B). La unidad asimétrica contiene dos SeqAΔ (41-59) de ADN A25R complejos donde se muestra la proteína en gris, mientras que el ADN se muestra en color naranja. Symmetria relacionada SeqAΔ (41-59)-A25R moléculas de ADN se muestran en blanco para la proteína y amarillo para el ADN. Esta cifra se preparó utilizando PyMOL 12. Esta cifra está relacionada con película 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . Película 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Uno de los mayores retos en macromolecular cristalografía de rayos X es la obtención de cristales de difracción de calidad. En el caso de complejos de proteínas o ADN-proteína, este reto se agrava debido a las variables adicionales que deben ser optimizados. Se cree ampliamente que la longitud del ADN y la presencia de voladizos pegajosas para mejorar la asociación de moléculas de ADN vecinos en un tiempo pseudo-duplex son los principales parámetros a optimizar. Sin embargo, hemos demostrado que la naturaleza y ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (TDT) </td><td> Bio Basic Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sodio (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Urea </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrilamida </td><td> Bio Basic Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> El ácido bórico </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno FF cianol </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema Dual Adjustable Gel Vertical </td><td> CBC Scientific Company Inc. </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Índice de pantalla cristalización </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Asistente Yo pantalla cristalización </td><td> BioSystems Esmeralda </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II pantalla de cristalización </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Clásicos pantalla cristalización </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate bandejas </td><td> Art Robbins Instrumentos </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluciones Proteína tampón de purificación: 100 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT y 5% de glicerol. Proteína tampón de almacenamiento: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA y 5% de glicerol. Gel mezcla de carga: Añadir 20 g de sacarosa, 25 mg de azul de bromofenol, 25 mg de xileno cianol FF, 1 ml de 10% w / v de SDS y 10 ml de TBE 10X a 70 ml de ddH autoclave 2 O. Se agita con calentamiento suave hasta que la sacarosa se disuelve y ajustar la finalvolumen a 100 ml con ddH autoclave 2 O. Almacenar a 4 ° C. Tampón de carga 2X: Añadir 11 g de urea a 10 ml de mezcla de carga de gel. Se agita sobre una placa caliente hasta que se disuelve la urea. Dividir en partes alícuotas en tubos de 2 ml y se almacena a 4 º C. Mezcla PÁGINA 10X: Mix 420,4 g de urea, 100 ml de TBE 10X (autoclave), 250 ml de 40% 29:1 Bis / acrilamida en ddH 2 O. Agitar hasta que esté totalmente disuelto y ajustar el volumen a 1 litro. Almacene en botellas oscuras a 4 ° C. 10X TBE: Disolver 108 g de TRIS, 55 g de ácido bórico y 9,3 g de EDTA en 1 litro de ddH 2 O. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Tampón de elución: Diluir 8 ml de 5 M NaCl, 2 ml de 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml de 0,5 M EDTA pH 8 en 200 ml de ddH 2 O. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SEQA es un regulador negativo de la replicación del ADN que impide prematuros eventos reiniciación por secuestrantes GATC grupos hemimethylated dentro del origen de replicación 1. Más allá del origen, SEQA se encuentra en las horquillas de replicación, donde se organiza ADN recién replicado en mayores estructuras ordenadas 2. Asociados SEQA sólo débilmente con las secuencias GATC individuales, sino que forma complejos de alta afinidad con dúplex de ADN que contienen múltiples sitios GATC. La unidad mínima funcional y estructural de SEQA es un dímero, lo que explica el requisito de al menos dos secuencias GATC para formar un complejo de alta afinidad con el ADN hemimethylated 3. Además, la arquitectura SEQA, con la oligomerización y dominios de unión al ADN separados por un enlazador flexible, permite la unión a repeticiones GATC separados por hasta tres vueltas helicoidales. Por lo tanto, la comprensión de la función de SEQA a nivel molecular estructural requiere la analisis de SEQA unido a múltiples secuencias GATC. En la cristalización de proteínas-ADN, el ADN puede tener ninguno a un efecto excepcional en las interacciones de embalaje en función de los tamaños relativos y la arquitectura de la proteína y el ADN. Si la proteína es más grande que el ADN o huellas de la mayoría del ADN, el cristal de embalaje es principalmente mediada por interacciones proteína-proteína. A la inversa, cuando la proteína es del mismo tamaño o más pequeño que el ADN o sólo cubre una fracción de las interacciones ADN, ADN-ADN y ADN-proteína dominar cristal de embalaje. Por lo tanto, la cristalización de proteínas de ADN complejos requiere el cribado sistemático de ADN de longitud y 4 extremos de ADN (romo o saliente) 5-7. En este reporte se describe cómo diseñar, optimizar, purificar y cristalizar hemimethylated dúplex de ADN que contienen repeticiones en tándem GATC en el complejo con una variante dimérica de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obtener cristales adecuados para la determinación de la estructura.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Estructura cristalina de los complejos de proteínas de ADN puede proporcionar información sobre la función de proteínas, el mecanismo, así como, la naturaleza de la interacción específica. Aquí reportamos cómo optimizar la longitud, la secuencia y los extremos del ADN dúplex en co-cristalización con<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SEQA, un regulador negativo de la iniciación de la replicación.

Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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Biology

9.9K vistas.  McMaster University. Estructura cristalina de los complejos de proteínas de ADN puede proporcionar información sobre la función de proteínas, el mecanismo, así como, la naturaleza de la interacción específica. Aquí reportamos cómo optimizar la longitud, la secuencia y los extremos del ADN dúplex en co-cristalización con Escherichia coli SEQA, un regulador negativo de la iniciación de la replicación.

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Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Investigación

Bioquímica

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Química

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Biología

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Diseño y síntesis de un ADN Reconfigurable acordeón Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

Bioingeniería

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Condensados biomoleculares versátiles de nanoestrellas de ADN anfifílico o estrellas C

Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be used to establish compartmentalization and sustain life-like responses. Synthetic DNA nanostructures have demonstrated significant potential as condensate-forming building blocks owing to their programmable shape, chemical functionalization, and self-assembly behavior. We have recently demonstrated that amphiphilic DNA "nanostars", obtained by labeling DNA junctions with hydrophobic moieties, constitute a particularly robust and versatile solution. The resulting amphiphilic DNA condensates can be programmed to display complex, multi-compartment internal architectures, structurally respond to various external stimuli, synthesize macromolecules, capture and release payloads, undergo morphological transformations, and interact with live cells. Here, we demonstrate protocols for preparing amphiphilic DNA condensates starting from constituent DNA oligonucleotides. We will address (i) single-component systems forming uniform condensates, (ii) two-component systems forming core-shell condensates, and (iii) systems in which the condensates are modified to support in vitro transcription of RNA nanostructures.

Autor destacado: Desarrollo de células sintéticas a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico programables

We present a protocol for preparing synthetic biomolecular condensates consisting of amphiphilic DNA nanostars starting from their constituent DNA oligonucleotides. Condensates are produced from either a single nanostar component or two components and are modified to sustain in vitro transcription of RNA from an embedded DNA template.

Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be ...

Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Resumen

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Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Diseño y síntesis de un ADN Reconfigurable acordeón Rack

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico

Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico