Este trabajo fue apoyado por un Premio al Investigador Burroughs Wellcome para YM y por una beca postdoctoral de Brown-Coxe de la Universidad de Yale a MD.

Materiales: <ul><li> Muestra de la proteína - lisozima (50 mg / mL) </li><li> Colgando caída de 24 y la bandeja </li><li> Sentado caída de 24 y la bandeja </li><li> Batch de cristalización 96 bandeja y </li><li> Soluciones de cristalización (ya sea comercial, o de fabricación casera) </li><li> Grasa de silicona </li><li> 5 ml jeringa sin Luer-lock </li><li> Diapositivas con silicona cubrir </li><li> Cinta aislante óptico </li><li> Parafina </li><li> 0.1-2 l micropipeta con puntas de baja retención </li><li> Pinzas </li><li> Toallitas profesional </li></ul> 1. Colgando de estar / Procedimiento de caída: <ol><li> Para una pantalla inicial se puede utilizar pantallas disponibles en el mercado que aprovechan la matriz dispersa incompleta método factorial de las condiciones de ensayo. La matriz dispersa incompleta método factorial está sesgada por y seleccionados de las condiciones de cristalización de macromoléculas conocido (Carter y Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik y Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Si la condición de cristalización que ya se sabe, una pantalla estrecha se puede montar, la variación de la concentración y el pH de precipitación de todo el éxito original. El precipitante más exitoso es el polietilenglicol (PEG), seguido de sulfato de amonio. En conjunto, estos dos factores precipitantes cuenta de aproximadamente el 60% de todos los factores precipitantes macromoleculares registrado utilizados para la cristalización (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li> Prepare las soluciones de cristalización. Por lo general, estas condiciones se combinan de un agente de precipitación, la sal de algún tipo y un tampón para ajustar el pH. En algunos casos se pueden añadir aditivos específicamente para la proteína de interés. Todas solución madre debe ser filtrado con filtro de 0,22 micras. Algunas de la solución podría ser muy viscoso (50% PEG, glicerina, PEG-MME, etc.) <ul><li> Preparar 1.5 mL de 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 M NaCl en cada una de 0,1 M pH 4,0 NaOAc, 4.3, 4.6 y 4.9 (un total de 24 soluciones) </li></ul></li><li> Descongele la muestra proteínas y mantener en hielo. Reservas de proteínas debe ser almacenadas a -80 ° C a menos que la proteína de interés es sensible a la congelación / descongelación (si es así, se almacenan a 4 ° C). Las concentraciones típicas de proteínas están en el rango de 50-50 mg / mL, con concentraciones más altas suelen dar mejores resultados. </li><li> Girar la muestra 15min/18, 000xg / 4 ° C - algunas proteínas tienden a parcialmente agregan y precipitan tras un paso deshielo. Estos agregados pueden promover la precipitación amorfa del resto de las moléculas de proteína por lo tanto, giro completo hacia abajo se asegurará de que sólo las moléculas solubles en la muestra. Impiden que la proteína en hielo hasta la creación de la bandeja. </li><li> Determinar la concentración de proteínas a partir de su absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro UV. La concentración de proteína puede ser calculada a partir de la lectura y el coeficiente de absorción de la proteína extinción. El coeficiente de extinción puede ser calculado con la herramienta ProtParam en el sitio web Expasy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> Llenar los pozos de los colgantes de 24 y / sala bandeja de caída con 500 l de la solución precipitante de acuerdo con el esquema de configuración de la bandeja (Figura 2B). Crear un anillo de grasa de silicona alrededor del borde del pozo. El anillo debe tener un pequeño espacio para evitar la acumulación de presión de aire en el pozo está sellado. En forma de gotas de estar, no hay necesidad de grasa ya que el pozo está sellado con cinta adhesiva (Figura 2A). </li><li> Tome una tapa deslizante y limpia con spray de aire condensado, o un profesional limpiar - el polvo para evitar facilitará la interpretación de la caída de la cristalización y eliminar la contaminación. Para sentarse gotas, deslice la cubierta no se utilizan. En cambio, el pozo tiene una estantería en la que se mezclan la proteína y precipitante. </li><li> Ponga volúmenes iguales de la muestra de la proteína y la solución de reserva de la tapa deslizante. Diferentes volúmenes de la proteína y precipitante puede ser tratado como parte del proceso de optimización. El uso de más proteína que los resultados de precipitación en una concentración neta de la proteína en la caída después del equilibrio, que puede ser deseable para diluir las muestras de proteínas, y para frenar la nucleación de cristales o de crecimiento. Cualquier otra sustancia volátil en la solución de colocar también se concentrará en el mismo factor. Cuando la proteína de pipeteo y soluciones de depósito en la tapa deslizante, extremar las precauciones para evitar la formación de burbujas. A menudo, esto ocurre cuando el aire es expulsado de la pipeta. <ul><li> Colgando caída: 2 l de carga de 50 mg / ml lisozima en 0,02 M de pH 4,9 a NaOAc el centro de la tapa deslizante y añadir a 2 l de la solución de reserva. </li><li> Sentado gota: 2 l de carga de 50 mg / ml de solución de lisozima en el centro de la plataforma y agregar a ella 2 l de solución de reserva. </li></ul></li><li> Voltear la tapa deslizante con cuidado y ponerla en el anillo de grasa en la parte superior del pozo. Presione con suavidad para que el aire puede escapar del pozo a través de la muesca de la grasa para prcaso de la acumulación de presión de aire en el pozo y mantener el bien cerrados. Acumulación de presión de aire en el pozo puede aumentar la tapa deslizante, lo que compromete el sello también. En el método de la gota sentada, cinta adhesiva transparente ópticamente transparente se utiliza para cubrir los pozos. Por lo tanto, en este método de sellado se llevará a cabo todas las filas / columnas. </li><li> Pasar a la siguiente, así hasta que la bandeja está completa. </li><li> Compruebe la bandeja de la configuración del - la eliminación de partículas de polvo y otros contaminantes puede reducir la identificación de falsos positivos de cristales de proteínas. </li><li> Use una hoja de puntuación para documentar su experiencia. </li><li> Coloque la bandeja en la temperatura de incubación deseado, por lo general entre 4 ° C y la temperatura ambiente. 20 ° C es el más exitoso. Tenga cuidado al manejar la bandeja con cuidado y evitar cualquier agitación. Tenga cuidado al abrir y cerrar la puerta de la incubadora. Vibraciones o cambios de temperatura durante el traslado o la incubación puede prevenir el crecimiento de cristales o afectar negativamente a la calidad del cristal. Un shock de material absorbente (espuma de empaque, por ejemplo) puede ser utilizado como relleno en las bandejas de cristal. </li><li> Compruebe la bandeja de cristales al día siguiente, y luego cada pocos días, siempre el manejo de las bandejas con cuidado. Documento las conclusiones y morfologías caída de una hoja de la bandeja de puntuación específica. Los cristales suelen tardar 2-5 días en aparecer, aunque en ocasiones aparecen cristales mucho antes (casi de inmediato) o posterior (hasta varios meses!). Una vez que las condiciones de cristalización se han identificado y la tasa de crecimiento de los cristales es conocida, lo mejor es dejar las bandejas tranquilo hasta que los cristales han aparecido y crecido por lo menos a la mitad de su tamaño final. Dejando las bandejas sin perturbaciones pueden reducir el número de eventos de nucleación de cristales, por lo tanto, producir un número menor de grandes cristales. </li></ol> 2. Batch de procedimiento: <ol><li> Muestra de la proteína y la preparación de precipitación son como se describió anteriormente. </li><li> Pistola de aire una bandeja batch nuevo para evitar el polvo y otras partículas grandes. </li><li> En la bandeja de batch, llenado de aceite de parafina hasta 3 mm de alto (lo suficiente para cubrir los pozos). Eliminar el acceso de petróleo. </li><li> Cargar una L de solución de proteína (50 mg / ml lisozima) en el aceite precargada así - asegúrese de que la solución de pipeta directamente al fondo del pozo (Figura 2). </li><li> Cargar una L de solución precipitante en el acuerdo, así que el esquema de configuración de la bandeja (Figura 2B) - asegúrese de que la caída se hunde hasta el fondo del pozo y se funde con la gota de proteínas. </li><li> Pasar a la siguiente, así hasta que la bandeja está completa. </li><li> Siga los pasos 11-14 de la cortina de estar / drop procedure. </li></ol> 3. Los resultados representativos: La cristalización es generalmente conocido como el cuello de botella de la cristalografía de rayos X. Una matriz dispersa incompleta pantalla factorial de las condiciones de precipitación suele producir muchos tipos diferentes de agregación de la proteína y las precipitaciones, entre ellos grandes monocristales. Si la proteína o las concentraciones de precipitación son muy altos se puede ver la materia de color marrón con forma distinta y no el tamaño (precipitación amorfa). Cuando la solución es insaturada, la caída suele ser del todo claro y carente de cualquier tipo de precipitación. La Figura 3 muestra varios ejemplos de los fenómenos de precipitación y cristales (Dessau et al., 2006). Más fenómenos de precipitación con una interpretación más detallada se puede encontrar en <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. El principio de la cristalización de proteínas. El principio de la cristalización de proteínas. En un experimento de difusión de vapor (A) volúmenes iguales de precipitación y las proteínas están presentes en la caída. El agua se difundirá a cabo y tanto la precipitación y la concentración de proteínas se duplicará hasta que se alcanza el equilibrio entre la gota y la solución de reserva. En la cristalización por lotes (B) de la precipitación y la concentración de proteínas no cambian durante el experimento. Punto A - proteína permanece undersaturated cristales no se pueden formar, punto B - nucleación de proteínas se producen, los cristales comenzaron a formarse y la concentración de proteínas en solución se reduce a la saturación. El punto C - proteína se precipita, pero los cristales pueden crecer todavía. (C) la cristalización de diálisis con un gel capilar conectado. Empiezan a aparecer cristales de la sal se difunde fuera de la muestra de proteína (y / o precipitante difunde en la muestra de proteína) a través del tapón de gel. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema típico de experimentos de cristalización de proteínas. (A) Procedimientos para colgar caída de la difusión del vapor, sentado caída de la difusión del vapor, y la cristalización de proteínas batch. En cada caso, un pequeño volumen de muestra de proteína concentrada se mezcla con un volumen igual o menor de precipitant solución y se dejó equilibrar. (B) Para la cristalización de la lisozima de pollo, una bandeja de 24 pocillos se configura con diferentes concentraciones de cloruro de sodio (la precipitación) y con 0,1 M de acetato de sodio como el tampón a pH diferentes (4,0 a 4,9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados típicos de un experimento de cristalización de proteínas. (A) la precipitación amorfo. Cuando la proteína o factor precipitante (o ambos) se encuentran en alta concentración. (B) La separación de fases. Proteínas o detergentes pueden separar a una fase diferente cuando se mezcla con ciertos factores precipitantes en alta concentración. (C) los cristales en forma de barra de proteínas de AtCSN7 obtenidos en polietilenglicol 8000 y el acetato de magnesio (Dessau et al., 2006). (D) lisozima cristales obtenidos en 1,0 M NaCl y el pH de acetato de sodio 4.9. (E) En virtud de las gotas saturadas por lo general siguen siendo claras. Fotografía por Moshe Dessau.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

En este artículo se describen y demuestran en general los protocolos actuales para la cristalización de proteínas. Ya que un procedimiento de múltiples pasos que hay algunas consideraciones hay que tener en cuenta. Cuando se trabaja con volúmenes muy pequeños (0.5-2 l), el secado de la caída debido a la evaporación es una preocupación importante. Por lo tanto, se recomienda trabajar en un entorno bien controlado (con flujo de aire de baja, alta humedad y control de la temperatura ajustada) y la adopción de una técnica que reduce al mínimo la exposición de la caída al aire libre. Por esta razón, es esencial para operar en un ambiente de trabajo bien organizado. Todos los reactivos deben ser preparados antes de la creación de la bandeja y equipo de laboratorio debe ser de fácil acceso (pipetors, puntas, tubos, trapos, etc.) Como regla general, tome sus proteínas de almacenamiento lo más cerca posible a la vez que será la creación de la bandeja. De esta manera, hay menos influencias ambientales en la muestra. Es muy importante para mantener el tubo de proteínas por el cuello del tubo y no en el fondo, donde la proteína es, por lo que la muestra no se calienta desde la temperatura de su cuerpo. Con las precauciones mencionadas, los márgenes de error experimental puede reducirse al mínimo, lo que aumenta la reproducibilidad de los resultados. Hay muchas posibles modificaciones de los protocolos descritos aquí. Se puede alterar la concentración de proteína, proteína / precipitante, la temperatura (4 ° C - 37 ° C), pH y varios aditivos se pueden añadir. Otro método relativamente común para la cristalización de proteínas es la diálisis. En este método, la solución de proteína se dializó contra una solución de precipitación a través de una membrana semi-permeable. Ensayos de diálisis son más complicados de instalar, pero una de las ventajas de la diálisis es que las condiciones de precipitaciones de baja fuerza iónica puede ser probada. Esto es deseable si la proteína es poco soluble en concentraciones de sal bajo, ya que la proteína se puede cristalizar como la sal se dializa lejos de la memoria intermedia de proteínas. Una fase sólida (gel) se puede utilizar para controlar la velocidad de la diálisis. Por ejemplo, un gel de agarosa en el interior de un capilar se puede utilizar como interfaz de difusión entre la proteína y las soluciones precipitantes (fig. 1C). El aumento de la concentración de un agente de precipitación en un punto justo por debajo de la sobresaturación y luego ajustar el pH o la temperatura para reducir la solubilidad de la proteína puede ser utilizado para cristalizar las muestras con baja concentración de proteínas. Modificación del pH se puede realizar muy bien con la técnica de difusión de vapor, cuando los ácidos volátiles y bases tales como ácido acético, hidróxido de amonio o de acetato de amonio se utilizan (McPherson, 2004). En la técnica de micro-lotes toda una serie de mezclas de aceite pueden ser probados para cubrir los pozos. Aceites de diferentes permeabilidades diferentes de evaporación, y por lo tanto, producir diferentes tipos de cambios en la concentración de la mezcla de proteína / precipitante en el aceite. La cristalización es un paso indispensable para la obtención de información estructural de las macromoléculas en casi atómica resolución. Los métodos descritos aquí son por lo tanto, fundamental para el estudio de los mecanismos de la enzima y proteína-proteína o proteína-ácidos nucleicos interacciones, y en última instancia, una de las herramientas más importantes en la estructura basada en el diseño y desarrollo de fármacos.

<table><tbody><tr><td>Lysozyme</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 well VDX Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning Vacuum Grease</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Siliconized glass circle coverslides</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% paraffin oil</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

protein crystallization for x-ray crystallography

Usando la estructura tridimensional de macromoléculas biológicas para deducir su funcionamiento es uno de los campos más importantes de la biología moderna. La disponibilidad de las estructuras de resolución atómica proporciona una comprensión profunda y única de la función de proteínas, y ayuda a desentrañar el funcionamiento interno de la célula viva. Hasta la fecha, el 86% de la Protein Data Bank (PDB-RCSB) las entradas son estructuras macromoleculares que se determinaron utilizando cristalografía de rayos X. Para obtener cristales adecuados para los estudios de cristalografía, la macromolécula (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos y complejos proteína-proteína o proteína-ácido nucleico complejo) debe ser purificado a homogeneidad, o lo más cerca posible a la homogeneidad. La homogeneidad de la preparación es un factor clave en la obtención de cristales que se difractan a alta resolución (Bergfors, 1999; McPherson, 1999). La cristalización requiere llevar la macromolécula a la sobresaturación. La muestra, por tanto, concentra a la mayor concentración posible, sin causar la agregación o precipitación de la macromolécula (generalmente 20-50 mg / ml). La introducción de la muestra a un agente precipitante no puede promover la nucleación de cristales de proteínas en la solución, lo cual puede resultar en grandes cristales tridimensionales de crecimiento de la solución. Existen dos técnicas principales para obtener cristales: la difusión del vapor y la cristalización por lotes. En la difusión del vapor, una gota que contiene una mezcla de soluciones de precipitación y de la proteína se encuentra sellado en una cámara con precipitación puro. El vapor de agua se difunde fuera de la gota hasta que la osmolaridad de la gota y la precipitación son iguales (fig. 1A). La deshidratación de la caída provoca una lenta concentración de proteínas y precipitación hasta que se alcanza el equilibrio, a ser posible en la zona de la nucleación de cristales del diagrama de fase. El método se basa en lotes con lo que el de proteínas directamente en la zona de la nucleación de la proteína se mezcla con la cantidad apropiada de precipitación (fig. 1B). Este método se realiza generalmente bajo una parafina / mezcla de aceite mineral para evitar la difusión de agua de la gota. Aquí se muestran dos tipos de montaje experimental para la difusión del vapor, colgando caer y caer sentado, además de la cristalización por lotes en el aceite.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitation. Figure 3 shows several examples for precipitation phenomena and crystals (Dessau et al., 2006). More precipitation phenomena with more detailed interpretation can be found at <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a>.
	<img fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1highres.jpg" alt="Protein crystallization phase diagram, nucleation process, experimental setup, precipitation analysis." data-altupdatedat="1747911167000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. The principle of protein crystallization. 
The principle of protein crystallization. In a vapor diffusion experiment (A) equal volumes of precipitant and protein are present in the drop. Water will diffuse out and both the precipitant and protein concentration will be doubled until equilibrium is achieved between the drop and the reservoir solution. In batch crystallization (B) the precipitant and protein concentration do not change during the experiment. Point A - Protein stays undersaturated no crystals can be formed, Point B - Protein nucleation occur, crystals began to form and the concentration of protein in solution drops to saturation. Point C - Protein precipitates, but crystals may still grow. (C) Dialysis crystallization using a gel-plugged capillary. Crystals appear as salt diffuses out of the protein sample (and/or precipitant diffuses into the protein sample) across the gel plug.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2285/2285fig1highres.jpg" target="_blank">Click here to view larger image</a>.
	<img fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2highres.jpg" alt="Protein crystallization process diagram showing vapor diffusion and microbatch methods." data-altupdatedat="1747911167000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Outline of typical protein crystallization experiments. 
(A) Procedures for hanging drop vapor diffusion, sitting drop vapor diffusion, and microbatch protein crystallization. In each case, a small volume of concentrated protein sample is mixed with an equal or smaller volume of precipitant solution and allowed to equilibrate. (B) For the crystallization of chicken lysozyme, a 24-well tray is set up with various concentrations of sodium chloride (the precipitant) and with 0.1 M sodium acetate as the buffer at various pHs (4.0 - 4.9).
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2285/2285fig2highres.jpg" target="_blank">Click here to view larger image</a>.
	<img fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3highres.jpg" alt="Protein crystallization process, microscope images, crystal formation analysis, structural biology." data-altupdatedat="1747911167000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Typical outcomes of a protein crystallization experiment. 
(A) Amorphous precipitation. When protein or precipitant (or both) are in high concentration. (B) Phase separation. Protein or detergent may separate to a different phase when mixed with certain precipitants at high concentration. (C) Rod shaped protein crystals of AtCSN7 obtained in polyethylene glycol 8000 and magnesium acetate (Dessau et al., 2006). (D) Lysozyme crystals obtained in 1.0 M NaCl and sodium acetate pH 4.9. (E) Under saturated drops usually remain clear. Photography by Moshe Dessau.
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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

La estructura 3-D de una molécula proporciona un conocimiento único de cómo funciona la molécula. El principal método para la determinación de la estructura en casi atómica resolución cristalografía de rayos X. En este sentido, demostrar los métodos actuales de obtención de cristales tridimensionales de cualquier macromolécula, dado que son adecuados para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos X.

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

63.3K vistas.  Yale University. La estructura 3-D de una molécula proporciona un conocimiento único de cómo funciona la molécula. El principal método para la determinación de la estructura en casi atómica resolución cristalografía de rayos X. En este sentido, demostrar los métodos actuales de obtención de cristales tridimensionales de cualquier macromolécula, dado que son adecuados para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos X.

Video: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Investigación

Bioquímica

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Química

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Cribado de alto rendimiento para la cristalización de proteínas

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Autor destacado: Cribado de alto rendimiento para obtener resultados cristalinos para la cristalografía de proteínas  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Cristalización automatizada de proteínas y recopilación de datos en tiempo real

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

Autor destacado: Avance del análisis de la estructura de proteínas para el desarrollo de fármacos 

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.

Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Resumen

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Capítulos en este video

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

Microcristalografía de Protein Crystals y

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante