Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Médica y la Marie-Curie internacionales de reinserción programa de subvenciones (a JKV).

1. Recogiendo clones de cDNA de expresión <ol><li> La biblioteca de cDNA se ofrece como clones bacterianos individuales en las reservas de glicerol en un formato de 96 pocillos. El uso del comando Rearray en el menú selector de la CP7200 Norgen, recoger clones bacterianos de la placa de fuente e inocular 1,5 ml en LB / amp en un 96-pozos profundos (1 ml también) plato. </li><li> Sellar las placas de pocillos profundos con un sello permeable a los gases e incubar durante la noche a 37 ° C en un agitador. </li></ol> 2. Preparación de la biblioteca de expresión de ADNc <ol><li> Girar las placas de pocillos profundos que contenían las bacterias a 2.000 rpm durante 20 min utilizando adaptadores de placas en una centrífuga de mesa. </li><li> Aspirar los medios de los pocillos, dejando el sedimento bacteriano intacto. </li><li> Configurar la cubierta de la estación de trabajo de automatización de laboratorio, como se muestra en la Figura 2. Soluciones para la preparación de plásmidos se distribuyen en canales 1-5 y la placa de pozos profundos se coloca en la cubierta. A través de múltiples pocillos con solución de eluciónse coloca adyacente a la placa de pozos profundos. Consejos se cargan en los bastidores de punta. </li><li> Montar el colector de vacío. La placa de unión plásmido se coloca en el interior del colector y la placa de filtro plásmido se coloca en la parte superior del colector. </li><li> Resuspender pellet con 250 l Solución 1 (tampón de resuspensión) pipeteando arriba y abajo. </li><li> Lisar las bacterias mediante la adición de 250 l Solución 2 (tampón de lisis). La placa se sella y se invierte para permitir una mezcla completa. </li><li> Inicio 2 min temporizador. </li><li> Añadir 350 l Solución 3 (tampón de neutralización). Tapar la placa e invertir tres veces. </li><li> Transferir los lisados ​​bacterianos a las placas de filtro de plásmidos. </li><li> Aplicar vacío durante 5 min. </li><li> Retire la placa del filtro y colocar la placa de fijación en la parte superior del colector. Aplicar vacío durante 1 min. </li><li> Añadir 500 l de lavado adicional (AW) buffer. </li><li> Aplicar vacío durante 2 min. </li><li> Añadir 900 l de solución tampón de lavado 4. Aplicar vacío durante 2 min. </li><li> Repita step 2.14. Aplicar vacío durante 15 min adicionales. </li><li> Coloque la placa de colección de ADN en el interior del colector. Añadir 100 l de tampón de elución para la unión en placa y se incuba durante 2 min. </li><li> Vacío durante 10 min. </li><li> Retire la placa de recogida y concentración de ADN medida mediante el Nanodrop 8000. Típicamente un rendimiento de ~ 100 ng / l se puede esperar con este método. </li></ol> 3. Siembra Celular <ol><li> Las células HEK293 se tripsinizaron y se contaron. </li><li> 2 x 10 4 células se distribuyen en cada pocillo de una Viewplate PerkinElmer usando el ThermoFisher 96 pocillos multipunto. </li><li> Las células se incubaron durante la noche a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> 4. Transfección <ol><li> Preparar una mezcla de 100 ng GFP-Grb2 plásmido de ADN con 100 ng de ADNc en 25 l medio libre de suero por pocillo en un fondo redondo de 96 pocillos. </li><li> Añadir 25 mu l medios libres de suero que contienen 0,5 Transfectin l por pocillo. </li><li> Mezclar e iniciar el temporizador for 30 min. </li><li> Transferir 50 l de cDNA / Transfectin mezcla a las células utilizando un método de dispensación suave. Alternativamente, la mezcla de transfección se puede prescindir primero en placas de células y luego añadido en la parte superior (transfección inversa). </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> 5. Adquisición de imágenes <ol><li> Inicie el software Opera. Una instantánea de pantalla de la configuración del experimento se muestra en la Figura 3. Seleccione la ficha &quot;Configuración&quot; y seleccione 20x objetivo y el tipo de placa correcta. Asegúrese de &quot;collar&quot; está ajustado al valor correcto en el objetivo de permitir el enfoque con diferentes tipos de planchas. </li><li> Seleccione la opción &quot;Microscopio&quot; ficha. Definir una exposición como FITC (488 láser) y la exposición 2 como UV (365 láser). Activar el filtro UV en ambas exposiciones y asignar una exposición a la cámara 1 y 2 a la exposición la cámara 2. Establecer los tiempos de exposición a 800 ms de exposición 1 y 40 ms para la exposición 2. </li><li> Seleccione la opción &quot;Microscopio&quot; ficha. Definir eXposure 1 como FITC (488 láser) y la exposición 2 como UV (365 láser). Activar el filtro UV en ambas exposiciones y asignar una exposición a la cámara 1 y 2 a la exposición la cámara 2. Establecer los tiempos de exposición a 800 ms de exposición 1 y 40 ms para la exposición 2. </li><li> Seleccione exposición 1. Establecer el foco altura de 0 m. Seleccione &quot;Focus&quot;. Una vez centrado, exponga la cámara 1. Ajuste la altura de enfoque para optimizar el plano de exposición y haga clic en &quot;Take altura&quot;. Cambiar los tiempos de exposición y la potencia del láser para dar una intensidad de píxeles máximo de ~ 3.000. Guardar los parámetros de exposición. Repita el procedimiento para la exposición 2. </li><li> Seleccione &quot;Definición Experiment&quot; ficha. Crear un diseño y sublayout. Arrastre y suelte la disposición pertinente, la exposición, la imagen de referencia, archivo y skewcrop sublayout. Guardar experimento. </li><li> Seleccione &quot;Experimento automática&quot; ficha y adquirir imágenes. </li></ol> 6. Análisis de Imagen (Basado en ImageJ versión 1.46h.) <ol><li> Convertir el PerkinElmer propietario. Archivos flex para Tagged Image Format. Tif utilizando elFlex2Volocity Acapella guión. </li><li><ol><li> Importar imágenes en ImageJ como una secuencia de imágenes, lo que resulta en una pila. </li><li> Convertir la pila en un HyperStack 2 canales mediante la selección de la imagen / HyperStack / pila a punto del menú HyperStack. El número de cortes se debe establecer en medio de la pila importado. </li><li> Duplicar el canal GFP usando la imagen / comando Duplicar: marque la casilla Duplicar HyperStack y especificar los canales: 1-1. Allá usa la pila duplicado. </li></ol></li><li> Seleccione proceso / Mejorar contraste con píxeles 0,01% saturadas, utilizando histograma apilado y convertir a 8 bits con Image/Type/8-bit. </li><li> Definición de un radio de 15 píxeles local de segmentación adaptativa utilizando el algoritmo Bernsen con umbral de contraste (parámetro 1) q = 30. Marque las casilla de verificación objetos blancos en fondo negro en el menú Umbral Imagen / Ajustar / Auto Local. </li><li> Segmentación de control de calidad: generar superposición segmentada contorno de objetos en las imágenes originales. </li><li> Manipular las característicasre extracción mediante el análisis de partículas: área de medición, la media y la intensidad total de cada orgánulo. Guarde los archivos de resultados. </li><li> Abra el archivo de resultados de funciones en R y generar un histograma. </li></ol> 7. Los resultados representativos En condiciones normales Grb2 se localiza a lo largo de toda la celda. Tras la estimulación de un receptor del factor de crecimiento que se transloca a la membrana plasmática y posteriormente se internalizan en los endosomas, como se muestra en la Figura 4. La expresión de un receptor de superficie celular capaz de Grb2 de unión es suficiente para inducir esta translocación. En un experimento de selección típico, no hay cambio en GFP-Grb2 localización se observa. Sin embargo, cuando una proteína se expresa que Grb2 recluta a un sitio de la sub-celular, hay un cambio en la localización que puede ser fácilmente visualizado por microscopía de fluorescencia. Por ejemplo, la expresión de los resultados de EGFR en la relocalización de GFP-Grb2 a endosoma-como las estructuras (figura4). Por lo tanto, cuando se aplica una biblioteca de todo el genoma, se puede esperar que los nuevos Grb2 proteínas de unión a la superficie celular puede ser identificado. Este método no se limita a la detección de proteínas de superficie celular. Por ejemplo, Dynamin2 induce un cambio en la localización subcelular de GFP-Grb2 mostrar endosoma-como el reclutamiento (Figura 5). Dynamin2 se une al dominio C-terminal SH3 de Grb2 y está implicado en la endocitosis de este complejo de 9,10. Por lo tanto, este enfoque permite la identificación de complejos de proteínas de unión generales y no se limita a la identificación de compañeros de interacción para el dominio SH2. Varios tipos diferentes de translocación se puede esperar como la localización en la membrana plasmática, a endosomas, otras estructuras vesiculares citoplasmáticas o al núcleo. Por lo tanto, se recomienda que todas las imágenes también son inspeccionadas por ojo. Sin embargo, cuando la detección de grandes conjuntos de ADNc de un sistema automatizadoalgoritmo de análisis de imágenes es más práctico. En este caso, una combinación de algoritmos es deseable, tales como la detección in situ para identificar endosomas, citoplasma / núcleo de detección para identificar los algoritmos morfológicos nucleares shuttling y general para identificar cambios celulares de forma. El uso de estos métodos de detección fenotípicos diferentes se ha discutido en más detalle en otra parte 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema general del experimento. El experimento detalla un completo alto contenido de flujo de trabajo de cribado a partir de la amplificación y la preparación de la biblioteca de ADNc, la transfección de vectores de ADNc más construcciones reporteras, adquisición de imágenes y análisis de imágenes utilizando el software libre abierto ImageJ. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figura 2. Configuración de la plataforma de Tecan. (1) En el lado izquierdo, cinco canales 100 ml necesitan ser llenados con tampones 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) y A4 (100 ml). A4 Trough será necesario volver a llenar una vez durante el procedimiento. (2) El colector de vacío se encuentra en la posición 14 en este ejemplo. (3) La placa de pozos profundos con sedimentos bacterianos se encuentra en la posición 30, al lado de la cubeta tampón de elución con 25 ml de tampón de elución. (4) Puntas desechables para la cabeza 8-canales necesitan ser cargados en los bastidores de punta en el lado izquierdo y consejos para la cabeza multicanal deben llenarse en la posición 40. El manejador de Tecan FreedomEvo líquido que se utiliza en este experimento está equipado con 500 jeringas mu l. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Figura3. Automatización de la adquisición de la imagen en el LX Opera. A) Seleccione la ficha Configuración (1). Activar las líneas de láser requeridos para el experimento (2). Seleccione las cámaras para la adquisición de imágenes (3). Seleccionar el tipo de placa y la lente objetivo para el experimento (4). B) Seleccione la pestaña microscopio (1). Defina la fuente de luz y el tiempo de exposición de exposición 1 (2,3). Centrarse en un pozo y tomar altura (4). C) Seleccione la pestaña Definición Experiment (1). Arrastre y suelte la exposición, skewcrop, la referencia, el diseño y los archivos sublayout (2). Arrastrar y soltar el archivo de experimento (3). D) Selección automática Experiment (1). Arrastre y suelte los archivos experimento (2). Asignar código de barras correspondiente (3). Iniciar la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón de inicio (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. Grb2 translocación de GFP-expresión de cDNA. GFP-Grb2 se traslada desde una localización predominante citoplásmica a endosoma estructuras similares a la sobreexpresión de un receptor transmembrana del factor de crecimiento y posteriormente se internaliza a endosomas. A la izquierda, las imágenes de microscopía de Cos M6 células se muestran que fueron transfectadas transitoriamente con GFP-Grb2 (parte superior) o GFP-Grb2 más EGFR (parte inferior). Co-expresión de los resultados de EGFR en la reubicación de GFP-Grb2 a endosoma-como las estructuras. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplo de cDNA inducida por la translocación de GFP-Grb2. El Dynamin2 GTPasa, que está implicada en la endocitosis mediada Grb2, reubica GFP-Grb2 a endosoma estructuras similares (en el círculo). En este experimento, GFP-Grb2 fue co-transfectadas con DNM2 en células HEK293T. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 a las 24 horas y las imágenes fueron adquiridas en el Opera LX. Un campo de visión de la luz verde (GFP) de canal y la UV (azul; Hoechst 33342) se muestra.

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	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La clonación de expresión es una poderosa herramienta que se ha utilizado en el pasado para identificar nuevos componentes celulares tales como receptores de virus y antígenos de células sanguíneas 12. Aquí se describe un método para facilitar la identificación de nuevos supuestos receptores de transducción de señales que se unen a Grb2. Hay algunos pasos críticos en el protocolo. <ol><li> Para la preparación del plásmido automatizado es absolutamente indispensable contar con la completa resuspensión del sedimento bacteriano. A veces, es necesario incluir una etapa de agitación rigurosa o una nueva mezcla con pipetas. </li><li> Tras la adición de solución 2 y 3, mezcla completa es esencial y se ha encontrado que manualmente invirtiendo la placa sellado es más eficaz que el uso de un agitador automático. Pipeteado se debe evitar a este paso ya que conduciría a la cizalladura de la DNA. </li><li> En todos los pasos de vacío, hay que asegurarse de que el líquido es drenado completamentede la placa. De lo contrario rendimientos bajos son de esperar. </li><li> Tras la elución, es bastante común que eluato se forman gotas en la parte inferior de la placa de unión del plásmido. Estas gotas deben recogerse en la placa de elución, lo que se recomienda que la placa de fijación plásmido se levantó cuidadosamente y las gotas residuales en la parte inferior se transfiere cuidadosamente a la placa de eluato. </li><li> Durante la transfección, el momento de la formación del complejo es crítica. Por lo general, se adhieren a 20-30 min. Los tiempos más largos de hasta 1 h están bien sin reducción en el rendimiento, mientras que tiempos más cortos no son recomendados. </li><li> Para la microscopía, la elección de la ampliación es importante. En el sistema Opera LX utiliza aquí, la resolución de 20x es suficiente para obtener imágenes de alta calidad. Si imágenes de mayor resolución son necesarios, el objetivo puede ser cambiado, pero con el fin de obtener números estadísticamente significativos de las células, un mayor número de campos y mayores tiempos de adquisición se requieren. En general, nuestro objetivo esobtener al menos 100 células por pocillo fotografiadas. </li></ol> La translocación de ensayo Grb2 se ha usado por otros grupos para identificar inhibidores de molécula pequeña de EGFR activación de la quinasa 6. En ese caso, el EGFR se activa específicamente con el ligando provoca el reclutamiento de Grb2 a la membrana plasmática. La disrupción de esta interacción puede ser investigado el uso de compuestos de moléculas pequeñas. De manera similar, se puede prever que las pantallas de siRNA puede ser empleado para identificar genes endógenos implicados en la señalización EGFR-Grb2 o otros Grb2 de unión a receptores de factores de crecimiento tales como c-KIT o el receptor de eritropoyetina. Por lo tanto, hay múltiples aplicaciones potenciales de esta técnica. Un enfoque análogo podría aplicarse a sistemas reportero GFP-etiquetados para otras moléculas adaptadoras tales como Shc, Gab o IRS. Una ventaja importante de usar este ensayo basado en células en células de mamífero es que permite la identificación de rel fisiológicamenteinteracciones nentes. El ensayo es una lectura para la formación de complejos de proteínas, pero lo más importante, las interacciones de interés son controlados en la correcta celular sub-sitio. En este sentido, esta técnica supera los artefactos de otros métodos de interacción proteína-proteína, tales como la levadura de dos híbridos o en ensayos in vitro. Hay que señalar sin embargo, que las interacciones indirectas también puede dar lugar a reclutamiento Grb2. De manera similar, la transcripcional regulación de parejas de unión puede ser inducida por la expresión de cDNA. Para distinguir entre estas posibilidades, es necesario realizar los ensayos secundarios apropiados para distinguir entre los efectos de unión directos e indirectos. En conclusión, el ensayo molécula de GFP-adaptador translocación promete un alto potencial de todo el genoma de selección y aplicaciones de descubrimiento de fármacos.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> biblioteca de cDNA </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Permeable a los gases sella </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 Kit plásmido </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Freedom Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Con colector de vacío </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

La transducción de señales por los receptores del factor de crecimiento es esencial para las células para mantener la proliferación y la diferenciación y requiere un estricto control. La transducción de señales es iniciada por la unión de un ligando externo de un receptor transmembrana y la activación de cascadas de señalización corriente abajo. Un regulador clave de la señalización mitogénica es Grb2, una proteína modular compuesto de un interior SH2 (homología src 2) dominio flanqueado por dos dominios SH3 que carece de actividad enzimática. Grb2 está constitutivamente asociada con la GTPasa hijo de Sevenless (SOS) a través de su extremo N-terminal de dominio SH3. El dominio SH2 de Grb2 se une a receptores de factores de crecimiento en los residuos de tirosina fosforilados acoplando así la activación del receptor de la cascada SOS-Ras-MAP quinasa señalización. Además, otros papeles para Grb2 como un regulador positivo o negativo de la señalización y la endocitosis del receptor se han descrito. La composición modular de Grb2 sugiere que se puede acoplar a una diversidad de receptores y transductorese indica a lo largo de una multitud de diferentes vías de 1-3. A continuación se describe un ensayo de microscopía simple que supervisa el reclutamiento de Grb2 a la membrana plasmática. Está adaptado a partir de un ensayo que mide los cambios en la localización subcelular de la proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetados Grb2 en respuesta a un estímulo 4-6. Receptores de membrana plasmática que se unen Grb2 como receptor activado por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) recluta GFP-Grb2 a la membrana plasmática tras la expresión de ADNc y, posteriormente, trasladarse a endosomal compartimentos de la célula. Con el fin de identificar en los complejos de proteínas in vivo de Grb2, esta técnica se puede utilizar para realizar una escala del genoma de alto contenido de la pantalla basándose en los cambios en Grb2 sub-localización celular. La preparación de clones de cDNA de expresión, transfección y la adquisición de imagen se describen en detalle a continuación. En comparación con otros métodos genómicos utilizados para identificar socios de interacción de proteínas, tales como la levadura-dos-hybrid, esta técnica permite la visualización de los complejos de proteínas en células de mamífero en el sitio de la sub-celular de la interacción por un simple ensayo basado en microscopía. Por lo tanto ambas características cualitativas, como los patrones de localización puede ser evaluado, así como la fuerza cuantitativa de la interacción.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Un método de cribado de alto contenido para la identificación de nuevos receptores de señalización transmembrana competentes se describe. Este método es susceptible de automatización a gran escala y permite predicciones acerca<em&gt; In vivo</em&gt; Proteína de unión y la localización sub-celular de complejos de proteínas en células de mamífero.

Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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10.5K vistas.  University College London. Un método de cribado de alto contenido para la identificación de nuevos receptores de señalización transmembrana competentes se describe. Este método es susceptible de automatización a gran escala y permite predicciones acerca In vivo Proteína de unión y la localización sub-celular de complejos de proteínas en células de mamífero.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Investigación

Biología

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...