Alberto Guiggiani para el desarrollo del sistema de control en tiempo real, Evelina Chieregatti y Hanako Tsushima para discusiones interesantes, Giacomo PRUZZO y Alessandro Parodi para el desarrollo de la electrónica y de software a medida, y Claudia y Marina Chiabrera Nanni por su asesoramiento y asistencia en la preparación de cultivos celulares.

1. Configuración óptica El sistema óptico entero fue descrito anteriormente 15. En pocas palabras, el sistema de pinzas ópticas se basa en una onda continua de iterbio (CW) de fibra láser que opera a 1.064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulador espacial de luz (SLM) (LCOS-SLM, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varía la fase de la entrada del haz láser IR para controlar la posición del punto de enfoque de captura en la placa de cultivo por ordenador hologramas generados. Los Blue-pinzas de software (enlace web en la mesa de los equipos) hologramas generados libremente disponibles proyectados en el modulador espacial de luz. El interferómetro de medidas de espectroscopia de fuerza se basaba en un fotodiodo de cuatro cuadrantes (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) y un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs). La fuente de la disección láser fue un pulso sub-nanosegundo UV Nd: YAG a 355 nm (PNV-001525-040, PowerChip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acústico-modulador óptico (MQ110-A3-UV, 355 nm de sílice fusionados-AA-opto-electrónica) controla la potencia del láser UV entregado a la muestra. El holográfica pinzas ópticas y láser micro-disector se integraron en un microscopio vertical modificado (BX51 - Olympus) equipado con un 60X, 0,9 NA etapa de la inmersión en agua objective.The del microscopio se compone de un eje lineal 3-motor de corriente continua de micro-posicionamiento sistema (M-126.CG1, Física-Instruments) que lleva una etapa de nano-posicionamiento piezoeléctrico 3-eje por separado (P-733.3DD, Física-Instruments) para combinar el movimiento grueso de la muestra con una resolución sub-nanométrica del piezo- etapa. El sistema de platina del microscopio estaba equipado con dos lazos de control que actúa sinérgicamente para mantener el punto de enfoque de captura en la posición correcta, en función del modo de trabajo seleccionado (posición o fuerza de sujeción, estática o dinámica) 16. En particular, un circuito de retroalimentación interna actúa en una etapa piezoeléctrico, para mantener el talón en un selectoed distancia desde el centro de la trampa. El otro bucle externo controla la posición de la platina motorizada para explotar la región abarcada por el piezo-actuador en un área más grande que su carrera disponible 17. Cuando la etapa de piezo-alcanza el límite de la carrera disponible en una dirección, el bucle externo se mueve la etapa de micro en la dirección opuesta, por lo tanto el piezoeléctrico se recupera hacia su posición central porque es el seguimiento de la perla atrapado adherido a la muestra. Cuando la etapa de piezo-llega a la posición central de su gama supuesto, la etapa de micro detuvo. Otros detalles del sistema se presentan en la Guiggiani et al 16,17. Un dispositivo Peltier (QE1 calentamiento resistivo calentador con controlador de doble canal TC-344B - Warner Instruments) controla la temperatura del cultivo celular bajo el microscopio (37 ° C). En el cultivo, el pH y la humedad se mantuvieron en condiciones fisiológicas aireando un polidimetil de diseño personalizadosiloxano (PDMS) manga (integrando el objetivo del microscopio) con carbógeno humidificado (95% O 2, 5% de CO 2). 2. Cultivo de células Preparación Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano. Los cultivos primarios se obtuvieron de hipocampo de los ratones (C57BL6J, Charles River) en el día embrionario 18 (E18). <ol><li> Las neuronas se sembraron en placas a una concentración de 25.000 células / ml en el fondo de cristal placas de Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). Se necesita la baja concentración de células en cultivo para evitar la formación de una densa red ya en los primeros días in vitro. A la concentración celular se ha mencionado, la probabilidad de encontrar células aisladas con una neuritas ya no está conectado a otras células es mucho más alto. </li></ol> 3. Revestimiento de bolas <ol><li> Microesferas de polímero (Ø 4 m, COOH-terminal-Bangs Laboratories, código de producto PC05N/6700) fueron recubiertas con poli-D-lisina siguiendo el procedimiento descrito en el Kit de acoplamiento de proteínas polyLink (Polysciences, código de producto 19539). Las perlas se recubren con la misma molécula utilizada para cubrir el soporte de cultivo y las células favor adherencia. </li></ol> 4. Elija neurona aislada. Separe un cordón del sustrato Cultura, Trampa y Muévete Junto a la neurona <ol><li> Ponga la cultura placa de Petri en la platina del microscopio. Después de fijar la atención en la muestra por el movimiento etapa, corregir la posición del condensador objetivo esclarecedor establecer Kohler-iluminación. La alineación de la óptica de iluminación para establecer la condición Kolher-iluminación es necesaria para mejorar la calidad de la imagen de campo claro. El uso de tales condiciones de alineación, sino que también es necesaria para maximizar la eficiencia de recolección láser IR (a través del condensador objetivo), de la sonda atrapado dispersión, para llevar a cabo su seguimiento interferométrico por el QPD y PD. </li><li> Pipetear unos pocos l de la solución madre de microesferas recubierto ena la placa de cultivo. Las microesferas se depositará y se adhieren al sustrato de cultivo. El número de l inyectada en la placa de cultivo depende de la concentración de microesferas de la solución madre. La condición ideal es tener entre uno y dos microesferas por campo de la imagen de vista. Cuando demasiados microesferas se añaden a la placa de cultivo, que ya pueden adjuntar al azar a las neuronas cultivadas. </li><li> Desplazamiento en la placa de cultivo, en busca de una neurona aislada con neuritas más larga (el axón) y guardar la posición de la platina del microscopio. </li><li> Moverse y buscar un cordón adherido al soporte de cultivo. </li><li> Encienda el láser captura IR. En esta etapa, no hay hologramas se proyectan en el MST, y la posición del punto de láser IR coincide con la posición de la mancha láser UV. Ajuste la posición axial de la mancha IR 2-3 m por encima de la superficie de soporte de cultivo, por el movimiento de platina del microscopio. </li><li> Establecer la potencia del láser UV entregado a la muestra a menos de 1 mW. LaUV láser disector ha sido calibrado previamente 14: 5-6 mW el soporte de vidrio es destruida 4 mW una conexión neuronal se diseca completamente 2,5 mW de neuritas se lesionó parcialmente &lt;1 mW una onda de choque se produce en la placa de cultivo. La onda de choque óptica es lo suficientemente fuerte como para separar el talón desde el soporte de vidrio. </li><li> Encienda el láser UV, mientras que deja el láser IR, y mover el punto de UV por encima del cordón adherido al movimiento de platina del microscopio. Los separa del grano de la superficie, y es atrapada por el láser IR. A continuación, apague el láser UV. </li><li> Mueva las cuentas atrapados varios micrómetros por encima del soporte de vidrio (20-30 micras). El levantamiento del talón a esta posición evitará que entre en contacto con otras células, mientras que se está moviendo hacia la neurona previamente elegido. Lleve la cuenta de la posición de fase guardado anteriormente. Ajuste la velocidad de fase a un valor bajo (10 m / seg) por lo que la fuerza del fluido de arrastre no exceda de la trampa ópticafuerza de ping. </li></ol> 5. Mueva la Trampa posición con respecto al punto Dissector Laser y Axon Posición por ordenador holograma generado y calibrar la rigidez Pinzas Ópticas <ol><li> Mueva el talón hacia el soporte de vidrio para visualizar el axón. El talón se mantiene por encima de la celda para evitar el contacto con él (cerca de 5 m por encima del soporte de vidrio). </li><li> Mover la platina del microscopio para mover el punto de enfoque UV en el centro de la anchura del axón. Guardar la posición actual etapa. </li><li> Mover el enfoque posición al contado IR por holograma generado por computadora. En este paso, la etapa se detiene en la posición elegida en el paso anterior. Cuando se proyecta el holograma generado por ordenador en el SLM, el cordón atrapado se mueve con respecto al axón. Nos mover el punto del láser IR tener el talón atrapado alineada en el centro de la neurita, con el punto de láser UV centrado en la misma neuritas demasiado. El punto de IR y por lo tanto el talón atrapados están colocados a lo largo de los axones5-10 m de distancia de la mancha UV. Movemos la posición del IR con respecto a la tinta UV en función de la geometría de las neuritas. En el caso de las pinzas ópticas no están equipados con un sistema de SLM, la posición puede ser variada por los espejos basculantes, o deflectores acústicos, ópticos en la trayectoria óptica IR. El punto de láser IR puede estar situado 5-10 micras de distancia desde el punto de UV para evitar la interacción óptica del haz de disección con la sonda atrapada, lo que podría influir en su movimiento browniano y alterar los rastros de espectroscopia de fuerza. </li><li> Después de definir la nueva posición al contado IR con respecto al punto de UV y la posición del axón, mover el escenario para colocar la bola atrapado lejos del axón y evitar la colisión con él. Mover la posición axial de la perla atrapado a aproximadamente 2 micras por encima de la cubierta de vidrio. </li><li> Alinear el QPD al centro de las franjas de interferencia en él: las señales de diferencial y QPD x y son ceros cuando se centra la QPD. Adquirir 5 segundos del movimiento browniano de la perla atrapado por el interferometro, a 50 KHz de frecuencia de muestreo. Obtener la rigidez (pN / nm) y sensibilidad (V / nm) de la trampa óptica por el método de espectro de potencia 18. </li></ol> 6. Conecte el grano a la Axon. Realizar Medición Fuerza Axotomía y simultánea <ol><li> Elevar la posición del grano atrapado a unos 4 m por encima de la cubierta de vidrio, y moverlo a la posición de fase guardado previamente (véase el paso 3.2). </li><li> Mueva el talón hacia abajo atrapado hacia el axón hasta que haga contacto con la neuritas. La colisión entre el talón atrapado y el axón se controla por la señal de QPD z detección de desplazamiento de la bola atrapado en la dirección axial. </li><li> Espere 10 segundos con el talón atrapado empujado contra el axón para favorecer su adherencia a la membrana de neuritas. </li><li> Mover la etapa de micro para desplazar el talón atrapado desde el axón, y por lo tanto verificar su adhesión a la membrana celular. Si el cordón adherido, se escapa de la trampa óptica. </li><li> Retrocede la trampa láser en el cordón adheridoy active el circuito de fuerza con abrazadera condiciones fuerza igual a cero. De tal manera, los piezo-reposiciona la etapa de talón, que se adjunta a la célula, en el centro de la trampa óptica. Si el sistema no tiene un control de retroalimentación, la posición de la trampa láser puede ser movido por la platina del microscopio para centrarla en la sonda adherida. El centro de la trampa se alcanza cuando las señales QPD son los mismos que cuando la perla está atrapado y no se adhirió a la célula (x y las señales de QPD y igual a cero, y la señal de QPD z da el mismo voltaje suma de los cuatro cuadrantes como cuando la perla está atrapado lejos de cualquier superficie). </li><li> Establecer una condición de fuerza-abrazadera en el eje z, el posicionamiento del láser captura ligeramente sobre el centro de la perla (aproximadamente 100 nm), para generar una pretensión en la sonda atrapado adherido. En caso de que el sistema no está equipado con un control de la fuerza-abrazadera, la posición de trampa óptica puede ser levantado en pasos de 25 nm por la platina del microscopio. La señal z QPD permite monitorizar. Por lo tanto, utilizar this señal para establecer la posición de la trampa láser con respecto a la sonda adherida. Este tipo es necesario pre-tensión para detectar la tensión en la membrana después de la lesión axonal, y la consiguiente disminución del movimiento browniano de la sonda adherido. Un enfoque similar se ha propuesto para la medición de la liberación de la tensión en una correa de sujeción de membrana por imágenes de vídeo 19. </li><li> De desconexión de la regeneración de la fuerza de pinza para medir la fuerza en la sonda adherido en la condición de posición-abrazadera (la-etapa piezoeléctrico está bloqueado). </li><li> Inicio de la grabación simultánea de las posiciones de la sonda atrapados a través del interferómetro (20 kHz frecuencia de muestreo), y la célula durante láser axotomía de lapso de tiempo de imágenes de campo brillante (velocidad de cuadro 20 Hz). </li><li> Encienda el láser UV para entregar pulsos láser hasta que la lesión se hace visible en la imagen del axón (Por lo general se necesitan 200 a 400 pulsos ópticos de energía por pulso:. 25 NJ), a continuación, apague el láser UV. </li><li> Continuar el registro por el interferómetro de aproximadamente 3 millasn, hasta que la x, y y z QPD trazas alcanzar una meseta. </li></ol> 7. Cuantificar la tensión de liberación total <ol><li> Convertir las huellas QPD grabados (en voltios) por la sensibilidad calibrada de la trampa óptica, para obtener las respectivas huellas en nanómetros. </li><li> Se filtra la x, y, z y trazas de desplazamiento por un filtro de paso alto con corte a 10 Hz. </li><li> Calcular la varianza total de las huellas filtrados que representan el movimiento browniano de la perla atrapado. Calcular la varianza en 25 mseg para ventanas de tiempo de 500 milisegundos (10000 puntos de datos) 20 superpuestas. El filtrado de trazas de paso alto excluye los cambios de movimiento browniano debido a la fluctuación de la membrana o el movimiento cortical de actina. El movimiento browniano de la perla se reduce por las fuerzas ópticas y las fuerzas de adhesión en la membrana celular. Cuando la membrana se tensa debido a la liberación de la tensión su viscosidad se incrementa, y por lo tanto el movimiento browniano de la perla, detecta inmediatamentemente después de axotomía, comienza a disminuir. </li><li> Definir t0: el comienzo de la disminución de la varianza movimiento browniano, después de la entrega de la energía láser UV. En el instante t0 de tiempo indica el comienzo de la cepa de la membrana. </li><li> Definir t1: el final de la disminución de la varianza movimiento browniano (cuando se alcanza una meseta). En el instante en el tiempo t1 indica el final de la cepa de la membrana. </li><li> Realizar el seguimiento de vídeo de escombros o un rasguño en la cubierta de soporte de vidrio, para medir cualquier deriva de la muestra durante la medición de la fuerza. Para el seguimiento de la partícula en el soporte de vidrio, que primero aplicamos umbrales para las imágenes de campo brillante, para obtener una pila de imágenes binarias con la partícula en blanco sobre un fondo negro. A continuación, hacemos un seguimiento del centro de partícula de masa con una precisión sub-pixel (utilizando el software ImageJ freeware). </li><li> Restar la deriva medida a partir de las huellas QPD de desplazamiento. Multiplicar las huellas QPD deriva corregidos por el respectivo rigidez óptica calibrada (k x, k <sub&gt; y, z k) para obtener los Fx, Fy, Fz huellas en piconewtons. </li><li> Calcular la huella total de la fuerza como F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2). </li><li> Calcular la liberación total de la fuerza entre t0 y t1 como F = F lanzado tot (t1) - F tot (t0). La fuerza medida en t0 tiene que ser restado porque es debido al desplazamiento de la sonda desde el centro de la trampa, cuando las cuentas se adhiere a la neuritas. </li><li> Calcular el área de contacto entre el talón neuritas atrapado y la posición del punto láser UV: en la medida de campo claro la imagen de los ejes longitudinales (L) y cortas (D) de los axones entre el talón atrapados y la posición del punto láser UV. El área de contacto axón es un axón = L x D. </li><li> Normalizar la fuerza F lanzado total liberada por el área de contacto axón Un axón. </li></ol>

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	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria.">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology.">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li><li>Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+with+molecular+fluorescence+imaging+using+activatable+cell-penetrating+peptides+decreases+residual+cancer+and+improves+survival.">Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).</li><li>Stiess, M., Maghelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+extension+occurs+independently+of+centrosomal+microtubule+nucleation.">Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation.</a> Science. 327, 704-707 (2010).</li><li>Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+cell+fusion+in+combination+with+optical+tweezers:+the+laser+cell+fusion+trap.">Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap.</a> Cytometry. 12, 505-510 (1991).</li><li>Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+delivery+of+liposome+encapsulated+chemical+stimuli+to+neuronal+cells.">Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells.</a> J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).</li><li>Kress, H., Park, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stimulation+with+optically+manipulated+microsources.">Cell stimulation with optically manipulated microsources.</a> Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).</li><li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+laser+scissors+(microbeams).">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li><li>Difato, F., Dal, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+optical+tweezers+and+laser+dissector+for+controlled+ablation+of+functional+connections+in+neural+networks.">Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).</li><li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>O'Toole, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stretching+in+slow+axonal+transport.">The role of stretching in slow axonal transport.</a> Biophys. J. 100, 351-360 (2011).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Difato, F., Tsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+actin+waves+during+regeneration+after+axonal+lesion+is+enhanced+by+BDNF.">The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.</a> Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).</li><li>Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optical+manipulation+and+electrophysiological+tools+to+modulate+and+record+activity+in+neural+networks.">Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks.</a> International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+and+long-term+interferometric+tracking+by+static+and+dynamic+force-clamp+optical+tweezers.">Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers.</a> Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RealTime+Suite:+a+step-by-step+introduction+to+the+world+of+real-time+signal+acquisition+and+conditioning.">RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning.</a> 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decrease+in+membrane+tension+precedes+successful+cell-membrane+repair.">A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.</a> Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).</li><li>Kress, H., Stelzer, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+act+as+phagocytic+tentacles+and+pull+with+discrete+steps+and+a+load-dependent+velocity.">Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+mechanotransduction:+pathways,+probes,+and+physiology.">Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).</li><li>Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+surgery+and+optical+trapping+in+a+laser+scanning+microscope.">Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope.</a> Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion:+A+review.">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se presenta en este trabajo un método cuantitativo para comparar la adhesión de neuritas al sustrato de la cultura, mediante la realización de mediciones de espectroscopia de fuerza simultánea durante la lesión celular inducida por láser. La liberación de la tensión medida está relacionada con el grado de adhesión de la célula al sustrato: células con un mayor número de adhesiones focales deben liberar menos tensión. La medición de la liberación de la tensión en términos de piconewtons proporciona una ...

Microscopía óptica es uno de los sistema de imagen menos invasivo disponible para observar las células vivas. Con la explotación de efectos tales como la presión de la radiación (como en pinzas ópticas 1), o flujo de fotones de alta energía (como en láser disector 2), esta tecnología se extendió a nano-manipulación. El sistema de imagen óptica proporciona un control preciso de visualizar y manipular dianas celulares sub 3. Al mismo tiempo, gracias a la calibración precisa de la potencia del láser emitido, herramientas ópticas lograr ya sea suave o manipulación de la muestra invasiva con una reproducibilidad sin precedentes. Varios laboratorios integrados, en la misma configuración experimental, pinzas ópticas y disector de láser con el fin de realizar la ablación orgánulos 4, se fusionen entre sí diferentes células 5, o para estimular las células por impulsado ópticamente cargas 6,7. Si bien las pinzas ópticas, después de la calibración de la rigidez óptica, permitenel control de la fuerza aplicada a la celda en una escala picoNewton, sistemas de disección láser puede modular la manipulación óptica, que se extiende desde la membrana foto-poración a la ablación de orgánulos individuales o disección de las estructuras subcelulares. Sin embargo, la calibración de la disección con láser se basa en la evaluación cualitativa de la entidad de manipulación óptica con respecto a la energía entregada a la muestra, basado principalmente en el análisis de imagen que ilustra los cambios morfológicos causados ​​a la muestra 8. En el método presentado, nos demuestran cómo realizar mediciones de espectroscopia de fuerza durante la disección láser axonal de las neuronas en desarrollo, para cuantificar, en la escala picoNewton, la fuerza producida por una alteración del equilibrio en la estructura del citoesqueleto de un compartimiento subcelular 9. Neuronas cultivadas se adhieren al sustrato, y polarizan durante el desarrollo. La fase de polarización se produce durante los primeros cinco días in vitro. En la etapa dos de polarización, una de las extruidoción neuritas se hace más largo, y se diferencian para convertirse en el axón 10. Elongación axonal en respuesta a la fuerza de tracción en el cono de crecimiento se ha modelado previamente por el modelo de Dennerl 11. Recientemente, este modelo se ha ampliado para incluir 12 el papel de la adhesión de neuritas a los sustratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, propuesto después de observaciones experimentales 13, mostró que fuerzas de tracción en el cono de crecimiento, la propagación a lo largo de la neurita, son moduladas por las adhesiones focales al sustrato. Del mismo modo, lesión axonal produce una liberación local de la propagación de la tensión hacia el cuerpo de la célula. Por lo tanto, se propuso que la medición de tal tensión liberada en un lugar a lo largo del axón entre la lesión y el soma celular ofrece la posibilidad de evaluar el resultado de amortiguación de las adhesiones focales no afectadas. Calibramos la energía necesaria fotón de flujo del disector de láser para controlar la extensión de la damag axonal infligidae, de transección completa a lesión parcial. Después de la calibración, se repitió lesión parcial a los axones de varias diferenciación de las neuronas y el protocolo desarrollado para cuantificar la liberación de la tensión, y por lo tanto obtuvimos un parámetro cuantitativo para estimar la adherencia del axón al sustrato 14. En el presente trabajo se describe en detalle el protocolo desarrollado, lo que representa un procedimiento experimental precisa para evaluar y comparar con la sensibilidad picoNewton la adhesión axonal al sustrato en diferentes condiciones experimentales, tales como el tratamiento químico 14, o diferentes tipos de soporte de cultivo celular.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

La formación de conexiones funcionales en una red neuronal en desarrollo está influido por las señales extrínsecas. El crecimiento de axones de las neuronas en desarrollo está sujeto a las señales químicas y mecánicas, y los mecanismos por los que se detecta y responde a señales mecánicas, son poco conocidos. La elucidación del papel de las fuerzas en la maduración de las células permitirá el diseño de los andamios que puede promover la adhesión celular y del citoesqueleto de acoplamiento al sustrato, y por lo tanto mejorar la capacidad de los diferentes tipos neuronales para regenerarse después de una lesión. Aquí se describe un método para aplicar medidas de espectroscopia de fuerza simultáneas durante la lesión celular inducida por láser. Medimos liberación de la tensión en el axón parcialmente lesionada por el seguimiento interferométrico simultánea de una sonda atrapada ópticamente adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental detecta la liberación de la tensión con la sensibilidad picoNewton, y la dinámica de la liberación de la tensión enresolución de tiempo de milisegundos. Por lo tanto, ofrece un método de alta resolución para estudiar cómo el acoplamiento mecánico entre las células y los sustratos puede ser modulada por el tratamiento farmacológico y / o por las propiedades mecánicas distintas del sustrato.

La célula genera fuerzas de tracción sobre el sustrato mediante sus adhesiones focales. Fuerza generada por los elementos del citoesqueleto están en equilibrio con la fuerza que contrarresta del sustrato de cultivo. Después de la lesión inducida por láser de la neurita, algunos de los cables tensados ​​citoesqueleto se interrumpen y su tensión equilibrada se libera porque se elimina la fuerza de oposición de la adhesión sustrato. La tensión liberada se distribuye parcialmente en las adhesiones focales no a...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Se midió la liberación de la tensión en un axón que fue parcialmente lesionada con un disector de láser por la medición simultánea de espectroscopia de fuerza se realiza en una sonda ópticamente atrapado adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental desarrollado evalúa la adhesión axón al sustrato de cultivo.

Medición de la tensión de salida durante Laser Induced Axon lesión axonal a evaluar la adhesión al sustrato en picoNewton y Millisecond Resolución

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vistas.  National Research Council of Italy. Se midió la liberación de la tensión en un axón que fue parcialmente lesionada con un disector de láser por la medición simultánea de espectroscopia de fuerza se realiza en una sonda ópticamente atrapado adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental desarrollado evalúa la adhesión axón al sustrato de cultivo.

Video: Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

La detección de biomarcadores exosomal por inducida por campo eléctrico de lanzamiento y Medición (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Intraductal La entrega al conejo Glándula Mamaria

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ambiental análisis mecánico dinámico para predecir el comportamiento de ablandamiento de los implantes neurales

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Proyección de imagen integrina tensión y fuerza celular en la resolución del Submicron con un Sensor de tensión integradora

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...