Este protocolo permite la toma de imágenes directas de la población de neurofilamento en axones mielinados de ratones juveniles o adultos utilizando microscopía de fluorescencia, lo que permite medir la direccionalidad y velocidad del transporte de neurofilamento en segmentos nerviosos aislados. Este método depende de la disponibilidad de ratones que expresen una fusión fluorescente fotoactivable de la proteína de interés, pero se puede adaptar para su uso en cualquier nervio fácilmente diseccionado. Para empezar, vierta la solución salina oxigenada en una jeringa de 60 mililitros y asegúrese de que quede un aire mínimo en la jeringa.
Conecte la jeringa al tubo y, a continuación, coloque el tubo de salida en un matraz de residuos. Coloque la junta exterior en la carcasa de la cámara de perfusión, asegurándose de que los postes de entrada y salida de flujo estén alineados con los orificios de la junta, luego coloque la junta interior en un cubreobjetos circular número 1.5 y alisa cuidadosamente las arrugas en la junta para asegurar un sello hermético. Coloque el cubreobjetos y la junta en una toalla de papel o una toallita de tarea con la junta hacia arriba.
Utilice un par de tijeras de disección grandes para hacer una incisión dorsal en la piel cerca de la mitad de la columna vertebral y continuar cortando alrededor del aspecto ventral del animal. Tire lentamente de la piel del músculo y corte la fascia. A continuación, usa tijeras de microdisección para hacer una incisión en los músculos del muslo a medio camino entre la cola y la rodilla para exponer el nervio ciático.
Asegúrese de que el nervio, que es visible a través del músculo, no se corta. Extiende la incisión dorsal y ventralmente para eliminar el músculo, luego retira los músculos de la pantorrilla, manteniendo los cortes superficiales y cortos para evitar dañar los nervios. Continúe retirando los músculos hasta que el nervio tibial esté completamente expuesto desde el punto donde se ramifica desde el nervio ciático hasta el talón.
Agarra el nervio tibial en el extremo proximal de la columna vertebral con un par de fórceps y córtalo con un par de tijeras de microdisección, asegurándote de no aplicar demasiada tensión al nervio. Levantar cuidadosamente del músculo y cortar cualquier accesorio, teniendo cuidado de no poner tensión en el nervio. Cortar el extremo distal de la columna vertebral del nervio tibial y transferirlo a un pequeño plato Petri de solución salina oxigenada a temperatura ambiente.
A partir del extremo proximal del nervio, agarre suavemente los extremos del axón expuesto con un par de fórceps de punta muy fina. Con un segundo par de fórceps, agarre la vaina nerviosa de forma proximally y tire lentamente hacia el extremo distal del nervio asegurándose de que no se aplica ninguna tensión indebida durante este proceso. Sujete el extremo proximal del nervio y colóquelo lentamente sobre un cubreobjetos, luego enderecerlo bajo una tensión suave.
Coloque el microaqueducto deslizar sobre el nervio con el deslizamiento ranurado hacia abajo y coloque la dirección del flujo paralela al nervio. Voltee el conjunto de cubreobjetos y microaqueductos y colóquelo en la carcasa de la cámara de perfusión con la corredera opuesta a la junta exterior. Para fijar la cámara de profusión, colóquela en la carcasa metálica y gire el anillo de bloqueo.
Presione lentamente el émbolo de la jeringa salina y llene la cámara de perfusión. Mantenga el tubo de entrada y salida, el matraz de salida y la jeringa elevados por encima de la propia cámara en todo momento durante la configuración y la toma de imágenes. Transfiera el conjunto de profusión a una etapa de microscopio invertido y monte la jeringa salina en la bomba de la jeringa, luego encienda el motor y ajuste la velocidad para un caudal de 0,25 mililitros por minuto.
Conecte el calentador de solución en línea y establézcalo en 37 grados Centígrados. Conecte el calentador objetivo y establézcalo en 37 grados Centígrados. Aplique aceite al objetivo e inserte la cámara de profusión en el soporte de la etapa.
Aplique aceite a la almohadilla del calentador de la cámara y adjúntelo a la cámara de perfusión, luego conéctela y colóquela a 37 grados Centígrados. Bloquee la cámara de profusión en el adaptador de escenario y ponga el aceite objetivo en contacto con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara. Utilice la iluminación de Campo brillante para centrarse en la capa de axones en la superficie inferior del nervio más cercano a la superficie antideslizante.
Los axones mielinados se pueden identificar por la presencia de una vaina de mielina que es visible bajo la iluminación de luz transmitida de Brightfield sin mejora de contraste. Adquiera una imagen de referencia de Brightfield, registrando la direccionalidad del nervio, luego adquiera una imagen confocal usando un láser de 488 nanómetros y un filtro de emisión apropiado para GFP fotoactivable. Establezca la potencia del láser en aproximadamente cinco veces la potencia normal de imagen y adquiera una imagen con un tiempo de exposición de tres a cuatro minutos, luego adquiera otra imagen confocal para registrar la autofluorescencia previa a la activación después del paso de blanqueo.
Dibuje una línea paralela a los axones con una longitud igual al tamaño de ventana de activación deseado de la imagen de Brightfield. Usando esta línea como guía, dibuje una región rectangular de interés a través del campo de visión perpendicular a los axones. Active la fluorescencia GFP en esta región por excitación de patrón con la luz de 405 nanómetros, asegurándose de que una imagen se adquiere justo antes e inmediatamente después de la activación.
Cuando finalice la activación, inicie un temporizador de un minuto. Cuando se apague, comience la adquisición de una serie timelapse. Añadir 250 miligramos de polvo de fluoresceína a 0,5 mililitros de agua doble destilada y mezclar hasta que no haya partículas visibles, a continuación, girar la solución durante 30 segundos en una centrífuga de mesa para sedimentar cualquier material no disuelto.
Añadir ocho microlitros de solución de fluoresceína a una diapositiva y aplicar unuso de 1,5 cubreobjetos. Blot el exceso de líquido, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y deje que la diapositiva se seque. Coloque el lado del cubreobjetos deslizantes hacia abajo en la etapa del microscopio invertido y ajuste el enfoque en el plano delgado de la fluorescencia en la superficie del cubreobjetos.
Mueva la diapositiva para encontrar un campo de visión que no contenga burbujas de aire ni partículas de fluoresceína grandes y adquiera una pila Z que abarque seis micrómetros a intervalos de 0,2 micrómetros de modo que la imagen central sea el plano de enfoque original. Cierre todas las persianas de trayectoria de luz, incluido el obturador de la cámara, y ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición a cero segundos. Adquiera una pila de 100 imágenes con estos ajustes, que se promediarán para generar la imagen de campo oscuro.
Aquí se muestran imágenes representativas de experimentos de escape de pulsos y de propagación de pulsos. Para el método de escape de pulsos, la cinética de descomposición de fluorescencia en la región activada puede producir información sobre el comportamiento de pausa a largo y corto plazo. La región activada puede ser la abreviatura de estos experimentos.
Una región activada más larga se utiliza para el método de propagación de pulsos con el fin de proporcionar una mayor piscina de neurofilamentos fluorescentes. Esto alarga el tiempo durante el cual el aumento de la fluorescencia en las regiones de flanqueo sigue siendo lineal. Aquí se utilizan 15 ventanas flanqueantes de 15 micrómetros.
Se cuantificó la fluorescencia total de la ventana de medición. La descomposición es bifásica para el método de escape de pulsos con una descomposición exponencial inicial que representa la salida de neurofilamentos en pista y una segunda decadencia exponencial más lenta a los 10 a 20 minutos que representa la salida de filamentos fuera de pista. Para la estrategia de propagación de pulsos, los cálculos de la velocidad y la direccionalidad del movimiento dependen únicamente de los taludes en las ventanas de flanqueo.
Para las longitudes de ventana utilizadas aquí, la fase lineal se extiende durante unos cinco minutos. Aquí se muestra un timelapse de un nervio inhibido glucolíticamente, lo que demuestra una aparente reducción en el transporte fuera de la región activada. De hecho, las pendientes distales y proximales son significativamente más bajas en los nervios tratados con inhibidores.
También hay una disminución significativa en la velocidad de la población entre estas dos condiciones. Al intentar este protocolo, recuerde que es crucial apresurarse en la realización de las porciones de disección y montaje de la cámara a medida que la salud de los nervios disminuye después del sacrificio del animal. El cultivo celular neuronal puede permitir la medición y el análisis del movimiento de neurofilamentos individuales, lo que complementaría los datos de escala de población recopilados utilizando este protocolo.
