Determinación de clases totales de lípidos y lípidos en muestras marinas

Los métodos descritos aquí se refieren a compuestos que pueden definirse operativamente como lípidos marinos. La base de esta definición es su capacidad para la extracción líquido-líquido en disolventes orgánicos no polares, lo que proporciona un medio conveniente para separarlos de otros compuestos en una matriz acuosa. Su carácter hidrófobo facilita su aislamiento del agua de mar o de ejemplares biológicos, así como su enriquecimiento y la eliminación de sales y proteínas.

Para las muestras de agua de mar, el primer paso normalmente implica la separación en fracciones disueltas y particuladas definidas operativamente, generalmente por filtración. La fracción de partículas es la retenida por los filtros, y el tamaño de los poros es importante para definir el corte. Usando forrórceps de limpieza lipídica, coloque un filtro de fibra de vidrio de 47 milímetros que haya sido cenicado en un sistema de filtración limpio de lípidos.

Tome la muestra y agítela suavemente para volver a colocar cualquier partícula que pueda haberse asentado. Mida un volumen conocido. El volumen dependerá de la cantidad de material particulado en la muestra.

Cuando se mida el volumen, agregue succión al sistema de filtración y humedezca suavemente el filtro con agua de mar filtrada. Agregue toda la muestra lentamente al embudo de filtración y enjuague el cilindro graduado con agua de mar para asegurarse de que todas las partículas se agreguen al filtro. Enjuague el embudo del aparato para asegurarse de que todas las partículas se enjuagan en el filtro.

Tire de todo el líquido a través del filtro, pero no deje que el filtro se seque, ya que puede romper las células que están en el filtro. Tome las pórceps limpias con lípidos, doble el filtro por la mitad, luego dóblelo en tercios una vez más y luego por la mitad a lo largo. A continuación, el filtro se coloca en un vial limpio de lípidos.

Cubra el filtro con dos ml de cloroformo, cúbralo bajo nitrógeno y selle con cinta de teflón. En este punto, la muestra será estable en almacenamiento a menos 20 grados centígrados durante un año. Preparación de la muestra.

Mida un volumen conocido del filtrado en un cilindro graduado de vidrio limpio con lípidos. Coloque la muestra en un embudo separador limpio de lípidos y agregue aproximadamente 20 ml de cloroformo. Agite esta mezcla durante al menos dos minutos ventilando con frecuencia.

Después de la primera separación, eliminación del primer extracto y adición de ácido. Después de agitar la solución durante dos minutos, envuelva el embudo en papel de aluminio y espere hasta que se haya producido la separación, aproximadamente cinco minutos. Después de esperar la separación, retire la parte inferior del papel de aluminio para ver las dos capas.

Recoja la capa inferior en un matraz de fondo redondo limpio de lípidos, teniendo cuidado de no incluir ninguna de las capas superiores. Tapa el matraz de fondo redondo bajo nitrógeno y colócase en un congelador. Recupere el embudo separador y agregue ácido sulfúrico al líquido.

Añadir 0,25 ml por cada litro de agua de mar presente. Una vez que se haya agregado el ácido sulfúrico, agite el agua de mar suavemente, luego agregue otros 10 ml de cloroformo y agite vigorosamente mientras se ventila durante otros dos minutos. Luego permita la separación.

Segunda y tercera separación. Añadir de nuevo la capa inferior al matraz de fondo redondo sin incluir agua. Agregue una tercera cantidad de 10 ml de cloroformo y agite durante otros dos minutos con ventilación.

Después de la separación, coloque la porción final de cloroformo en el mismo matraz, y los extractos combinados se pueden evaporar por evaporador rotativo y transferir a un vial de dos ml. Arreglo. Para la configuración de extracción, necesitará un recipiente aislado lleno de hielo. Los disolventes incluyen cloroformo, agua extraída de cloroformo y cloroformo-metanol 2:1.

De esta solución, necesita aproximadamente un ml por muestra, así que hágalo en consecuencia. Todos estos disolventes deben colocarse sobre hielo para que estén fríos en el momento en que se inician las extracciones. Las muestras también van sobre hielo para que todo permanezca frío.

Molienda y extracción. Las muestras se han almacenado congeladas en dos ml de cloroformo, así que agregue un ml de metanol helado o medio pipeteo. Tenga cuidado al agregar el metanol para no tocar el vial con la pipeta.

Limpiar y homogeneizar tres veces con metanol y tres veces con cloroformo. Al moler, tenga cuidado de no cortar el vial de extracción en su mano en caso de que rompa el vial y evitar calentar la muestra. Moler rápidamente.

Una vez que la muestra se haya molido por completo, colórmela en hielo y lave las partículas restantes de la amoladora de nuevo en el vial con un ml de cloroformo-metanol 2:1. Si es necesario, use un juego de pórceps limpios con lípidos para forzar que las partículas vuelvan al vial antes de lavarlas. Tenga cuidado de no tocar la pipeta a la amoladora o la amoladora al vial.

A continuación, agregue 0,5 ml o un cuarto de pipeta de agua extraída del cloroformo sin tocar la amoladora o la amoladora al vial. Cuando se haya lavado la amoladora, toque la gota que cuelga de la amoladora al vial. Tapa y mantenlo en hielo hasta que esté listo para sonicar.

Doble pipeteo. Después de centrifugar, habrá dos capas en el vial: las capas orgánicas y acuosas. Para obtener la capa orgánica, se utiliza la técnica de doble pipeteo.

Para hacer eso, una pipeta corta de cinco centímetros con la bombilla puesta sueltamente se agarra entre el dedo índice y el dedo medio. Empuje suavemente la pipeta hacia abajo a través de las dos capas mientras apreta la bombilla haciendo que las burbujas salgan hasta el final. Cuando se alcance la parte inferior de la segunda capa, use el pulgar para quitar la bombilla sin dibujar la capa orgánica en la pipeta.

Con una pipeta de nueve centímetros aprieta la bombilla por completo. Coloque el extremo largo de la pipeta en la pipeta de cinco centímetros y retire la capa inferior a través de la pipeta de cinco centímetros. Este extracto se coloca en un vial limpio de lípidos.

Continúe quitando la capa inferior hasta que se elimine todo. Todas las capas de agrupado en el vial de lípidos limpios. Lavado de pipetas.

Retire la bombilla de la pipeta de nueve centímetros. Colóquelo en el vial con el extracto en él. Tome una pipeta llena de cloroformo limpio, y sin tocar la pipeta a la que se está lavando, rocíe el cloroformo alrededor del interior de la pipeta.

Gire suavemente esa pipeta mientras se lava. Tome una segunda pipeta de cloroformo y haga lo mismo con el exterior de la pipeta. Asegúrese de que todo el cloroformo corra por la pipeta y entre en el vial de extracción.

Cuando termine con la pipeta larga, tome la corta y repita, pero lave esto en el vial con la muestra. Detección de una muestra. Limpie una jeringa con cloroformo.

Tome una muestra de volumen conocido y enjuague la jeringa en la muestra. Extraiga la muestra más allá de la cantidad que desea detectar. Luego baje el émbolo a la cantidad que desee, asegurándose de que no haya burbujas de aire.

Utilice el botón para dispensar 0,5 microlitros y toque la gota a la varilla. Dejar secar antes de colocar la siguiente gota en el mismo lugar. Detecte todas las muestras en una línea en varillas sostenidas sobre el extremo de una placa caliente caliente.

Centrándose en la acetona. El enfoque de la muestra se realiza en 100%acetona. Agregue aproximadamente 70 ml de acetona al fondo del tanque de desarrollo.

Tome los dos bastidores y suébalos suavemente al tanque de desarrollo. Observe el frente del disolvente mientras sube la varilla hasta que la parte inferior del punto se fusiona con la parte superior del lugar. Retire las varillas.

Séquelos durante unos cinco segundos, luego repita el procedimiento. Si las muestras están muy concentradas, este enfoque se puede hacer por tercera vez. Primer sistema de desarrollo.

El primer sistema de desarrollo consiste en hexano, éter etílico y ácido fórmico en 98.5 a uno a 0.5. Comience enjuagando un cilindro graduado tres veces con hexano y desechando. Llene el cilindro graduado un poco más allá de 85 ml con hexano.

Luego use una pipeta y la botella de hexano para llenar el cilindro graduado a 90 mls. Luego lleve la parte inferior del menisco a la línea de 91 ml usando éter etílico, que le dará un ml de éter etílico. Añadir 0,5 ml de ácido fórmico con la jeringa Hamilton.

Pero primero enjuague la jeringa Hamilton tres veces con el ácido fórmico para asegurarse de que no quede cloroformo que se usó para enjuagar la muestra de la jeringa. Agregue dos jeringas completas o 25 microlitros a la vez para un total de 50 microlitros. Es importante que el ácido fórmico se enjuague de la jeringa inmediatamente con cloroformo para evitar corroer el metal de la jeringa.

Una vez que la jeringa Hamilton esté limpia, haga la solución hasta exactamente 100 ml con hexano y una pipeta. Luego tapa e invierte tres o cuatro veces. Vierta aproximadamente 30 ml en el tanque de desarrollo.

Use estos 30 ml para mojar el papel y enjuagar el tanque. Deseche la solución de enjuague. Agregue los 70 ml restantes al tanque de desarrollo.

Adición de bastidores al sistema de desarrollo. Agregar varillas al sistema de desarrollo es lo mismo para cada desarrollo. Asegúrese de que el temporizador esté configurado para el tiempo en que se desarrollarán las varillas.

Y luego tome los bastidores y baje suavemente en el tanque. Observe hasta que el frente del disolvente llegue a los puntos de la muestra, luego inicie el temporizador. Segundo sistema de desarrollo.

El segundo sistema de desarrollo es hexano, etileno y ácido fórmico, de 79 a 20 a uno. Entonces, como antes, enjuague el cilindro graduado tres veces con hexano. Agregue exactamente 20 ml de éter y luego un ml de ácido fórmico, lo que lleva el volumen a 21 ml.

Luego lleve el volumen a 100 mls con hexano. Añadir unos 75 ml de hexano con las bombas de botella. Y para la porción, use una pipeta.

Tapa e invierte varias veces. Agregue aproximadamente 30 ml al tanque de desarrollo para humedecer el papel y enjuagar el tanque. Deseche los 30 ml.

Agregue los 70 restantes y estará listo para el conjunto de varillas. Tercer sistema de desarrollo. El tercer sistema de desarrollo es una mezcla de cloroformo, metanol y agua extraída de cloroformo, 50, 40 a 10.

Enjuague el cilindro graduado tres veces con cloroformo. Añadir unos 45 ml de cloroformo. Usando una pipeta, lleve la parte inferior del menisco a la marca de 50 ml.

Añadir unos 38 ml de metanol. Lleve la parte inferior del menisco a la línea de 90 ml. Luego llene los últimos 10 ml con agua extraída de cloroformo.

Al igual que con los otros sistemas de desarrollo, invierta esto tres o cuatro veces, y luego vierta 30 ml en el tanque para humedecer el papel. Deseche esos 30 ml y agregue los últimos 70 ml en el tanque. Preparación del metanol.

Para componer la solución de Hilditch utilizada para la derivatización, llene un matraz aforado limpio y limpio de lípidos que también se haya secado o enjuagado tres veces más con metanol para eliminar cualquier cloroformo. Agregue metanol hasta que la parte inferior del menisco esté en la línea de contención. Después de medir el metanol, agregue sulfato de sodio que se haya secado durante al menos 24 horas a 60 grados centígrados.

Agregue suficiente sulfato de sodio para que cubra la parte inferior del matraz métrico de volumen. Una vez cubierto, invierta dos veces para que cualquier agua que esté en el metanol sea absorbida por el sulfato de sodio. Después de invertir y agitar, déjelo reposar durante al menos cinco minutos.

Añadiendo el ácido. Después de que el metanol se haya asentado cinco minutos, decántalo lentamente en la botella de vidrio final asegurándose de que todo el sulfato de sodio permanezca en el fondo del matraz volumétrico. El sulfato de sodio generalmente permanece en la parte inferior, por lo que todo el metanol debe verterse.

Deje secar el volumétrico con el sulfato de sodio en la parte posterior de la campana de humos. Agregue lentamente ácido sulfúrico al metanol usando un PIPETMAN. Agregue unas gotas a la vez para que el metanol no escupa.

Una vez que se haya agregado todo el ácido, tapa y revuelve suavemente para mezclar. La solución ya está lista para ser utilizada para derivados, pero debe ser compuesta semanalmente. Hacer los derivados.

De un vial de extracto que ha tenido el volumen llevado a una cantidad conocida, agite, luego retire una porción del extracto en un vial de 15 ml marcado y limpio de lípidos. La cantidad que elimine estará determinada por la concentración de la muestra del Iatroscan. Use una pipeta Drummond limpia con lípidos para extraer la muestra.

Una vez retirada la muestra, coloque el vial de 15 ml bajo nitrógeno para evaporar completamente el cloroformo. La muestra original se puede conservar y devolver al congelador. Cuando la muestra se seque, agregue 1,5 ml de diclorometano o una pipeta y tres ml de la solución de Hilditch que se hizo más temprano ese día o dos pipetas.

Esta solución se mantiene bajo nitrógeno, se vórtice y se coloca en el sonicador durante cuatro minutos antes de colocarse en un horno a 100 grados centígrados durante una hora. Detener la reacción. Después de calentar a 100 grados Centígrados durante una hora y enfriar, agregue lentamente 0,5 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio.

Las burbujas se producirán a medida que el ácido se neutralice. A continuación, añadir 1,5 ml de hexano. Recapitular y agitar vigorosamente.

Déjalo reposar para que se separe en dos capas. Procesar todas las muestras. Para cuando todos hayan terminado, el primero estará listo para el siguiente paso.

Eliminación de la capa superior. Una vez que se haya detenido la derivatización y haya una separación clara en el vial de 15 ml, retire la capa superior y colóquela en un vial de dos ml limpio de lípidos. Es mejor dejar parte de la capa superior que y colocar cualquiera de la capa inferior en el vial de dos ml.

Una vez que se ha eliminado la mayor parte de la capa superior, el resto de la solución se puede desechar. El extracto que se encuentra en los dos ml debe evaporarse completamente bajo una corriente suave de nitrógeno. Una vez que el vial está completamente seco, el hexano se puede volver a agregar, y luego la muestra debe sonicarse, mantenerse bajo nitrógeno y luego está lista para ir al GC. Resultados representativos.

Esta figura muestra cromatogramas TLC-FIC crudos de nuestro estándar, una dieta hecha con aceite de colza y tejido hepático de un salmón alimentado con esa dieta. La acuicultura, el sector de producción de alimentos de más rápido crecimiento, tiene que reducir su dependencia de la harina y el aceite de pescado de origen silvestre. Los aceites vegetales están siendo investigados como sustitutos del aceite de pescado en los alimentos acuícolas.

Y el hígado, el sitio principal para el metabolismo de los lípidos, es el objetivo del análisis. Podemos ver la prevalencia de triacilgliceroles en la dieta en el hígado, y también la importancia de los fosfolípidos de membrana en el hígado. Esta figura muestra cromatogramas de un estándar.

Lípidos y partículas de sedimentación recolectados frente a la costa aquí y lípidos en el misido recolectados cerca de la misma profundidad. Aquí, los cromatogramas se han procesado a través de un software de trazado. Al ser ricos en carbono con un valor energético muy alto, los lípidos son un componente importante de la productividad de las áreas de estantes, que son particularmente importantes para el ciclo del carbono.

Más producción primaria superficial llega al fondo marino en aguas menos profundas. Encontramos que el pequeño mysid tenía la mayor concentración de lípidos en nuestras muestras. La cera y los ésteres estériles se combinan aquí.

Y hay un pico de división debido a la presencia de altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados. La rapidez con la que el sistema Chromarod Iatroscan TLC-FID proporciona datos de clase de lípidos sinópticos a partir de muestras pequeñas lo convierte en una herramienta poderosa para examinar muestras marinas antes de realizar análisis cromatográficos más detallados. Tales análisis generalmente requieren la liberación de compuestos componentes de extractos de lípidos y derivatización para aumentar la volatilidad.