Este protocolo proporciona instrucciones para la construcción y el uso de un sistema de fotobiorreactor de columna de burbujas para cultivar microalgas, y debe ser de interés para cualquier persona que estudie biocombustibles de algel, tratamiento de aguas residuales o biología de algel. Hemos encontrado el sistema de reactores spire para producir resultados de alta reputación. El sistema de reactores también es personalizable a una amplia gama de algas y cuesta mucho menos que muchas ofertas comerciales.
Demostrando el procedimiento estará Qichen Wang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar la configuración de los fotobiorreactores de columna de burbujas, construya un conjunto de tapas ventiladas a partir de las tapas de plástico de las botellas de vidrio de un litro y tubos de hibridación como se describe en el protocolo de texto. Deslice un anillo O de 1/4 de pulgada sobre las bandas de rodadura de un accesorio de señuelo de montaje en panel de 1/8 de pulgada, y deslícelo en el orificio de 1/4 pulgada perforado en la tapa.
Deslice un segundo 1/4 de pulgada sobre los hilos para que la tapa se emparete entre los dos anillos O. A continuación, deslice una tuerca de fijación sobre los hilos y apriétela para fijar el señuelo de montaje del panel en su lugar. Ahora encaje para fijar los anillos en el señuelo masculino expuesto, proyectando desde la tapa.
Repita este procedimiento para cada orificio de la tapa. Para las tapas que se utilizarán en la columna de burbujas y los reactores de botella, conecte el señuelo hembra de 1/8 de pulgada a los accesorios de púas a 1 piezas de 1/2 pulgada de tubo de PVC ID de 1/8 de pulgada. Fije estos a cada uno de los accesorios de señuelo macho expuestos en la tapa.
Conecte una válvula de retención al extremo libre de una de las piezas de 1/8 de pulgada. A continuación, conecte un señuelo macho a la colocación de la púa a la segunda pieza de tubo de 1/8 de pulgada que se proyecta desde la tapa. Haga clic en el anillo de bloqueo giratorio en su lugar y fije un filtro de aire de 0,2 micras a esto.
Ensamblaje Compleat del sistema de entrega de aire, tanques de pescado, placas de agitación, y las luces como descried el protocolo de texto. Concentrar el stock de microalgas asentadas retirando el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Deje menos de 100 mililitros de medio en cada botella, pero evite eliminar las algas asentadas.
Suspenda y transfiera la lodo de algas a tubos estériles de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar 1.000 veces G durante cinco minutos para concentrar aún más las algas. En el gabinete de bioseguridad, retire suficiente sobrenadante para lograr un volumen total de aproximadamente 80 mililitros de concentrados de algas para 12 fotobiorreactores.
Evite aspirar el pellet. Transfiera el concentrado de algas a un recipiente de esterilización. Ahora, agregue seis mililitros de lodos de algas en cada fotobiorreactor con una pipeta serológica esterilizada de 10 mililitros.
Gire los biorreactores para mezclar las algas en el medio. Dibuje una muestra de dos mililitros de cada biorreactor utilizando una pipeta serológica y transfiera a un tubo de dos mililitros. Recoja una muestra de dos mililitros cada 24 horas para monitorear el progreso del cultivo.
Compruebe la muestra en busca de ph utilizando tiras reactivas y ajuste el reactor según sea necesario. Apriete las tapas del biorreactor y coloque todos los biorreactores en el baño de agua de la pecera. Ajuste la aireación, el dióxido de carbono y la iluminación a los niveles adecuados para la especie.
Gire la posición del biorreactor cada día después del muestreo. Aplicar 200 microlitros de cada muestra de cultivo triplicado a pozos de una microplaca de 96 pozos. A continuación, mida la densidad óptica a 550 nanómetros y 680 nanómetros.
Mida un volumen fijo de cultivo de algas de cada biorreactor con un cilindro de posgrado y transfiera en botellas de centrífuga. Centrifugar la cultura 4, 696 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante al aspirarlo cuidadosamente.
Transfiera los pellets a tubos etiquetados de 50 mililitros. Enjuague las botellas centrífugas con agua destilada y transfiera el contenido a los tubos de 50 mililitros. Asegúrese de que el volumen total no supere los 45 mililitros.
Después de lavar los pellets de algas como se describe en el protocolo de texto, deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 7,5 mililitros de agua destilada a cada tubo de 50 mililitros. Ahora, vórtice los tubos de 50 mililitros y transfiera los lodos de algas a tubos prepesados de 15 mililitros.
Enjuague los tubos de 50 mililitros con agua destilada adicional y transfiera el líquido a los tubos de 15 mililitros manteniendo el volumen total en esos tubos a menos de 12 mililitros. Después de centrifugar los tubos de 15 mililitros y desechar el sobrenadante como antes, congele los tubos con pellets a menos 80 grados centígrados durante al menos 30 minutos en preparación para el secado por congelación. Añadir 1,5 mililitros de disolvente folch a cada tubo de dos mililitros que contenga 20 miligramos de algas secas congeladas.
Vierta aproximadamente 0,5 mililitros de perlas de sílice de zirconia en cada tubo hasta que el nivel de líquido alcance dos mililitros. Homogeneizar las muestras de algas en un molino de cuentas durante 20 segundos a una velocidad de 6,5 metros por segundo. Transfiera los tubos a hielos durante 30 segundos para enfriar las muestras.
Luego, repita cinco veces más para extraer completamente los lípidos. Filtrar el homogeneizar a través de una jeringa de cinco mililitros que contiene un disco de malla de alambre de acero inoxidable para estirar las perlas, recogiendo el filtrado en un tubo de 15 mililitros. Lavar las perlas con 1,5 mililitros de disolvente folch, empujando el líquido con el siring según sea necesario.
Repita este lavado 2 veces más y recoja todo el filtrado en el tubo de 15 mililitros, produciendo un volumen final de aproximadamente seis mililitros. Añadir 1,2 mililitros de solución de cloruro de sodio al 0,9% al extracto de folch en el tubo de 15 mililitros, y vórtice para mezclar bien. Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 6.000 veces G durante cinco minutos.
Registre el volumen inferior de la fase de cloroformo al 0,1 mililitro más cercano utilizando líneas en el lado del tubo de 15 mililitros. A continuación, transfiera la fase inferior a una vil de vidrio utilizando una pipeta de pasto de vidrio. Para realizar el ensayo de lípidos neutros, diluir los extractos de lípidos y el aceite vegetal estándar tres veces con metanol.
Por cada comprimido, la muestra añade 80 microlitros a una microplaca de polipropileno de 96 pocótanos en cuadrúplica. Para el disolvente en blanco, aplique 80 microlitros de disolvente folch en cuadrúplica. Para las normas, agregue 10, 30, 60, 90 y 120 microlitros del estándar de aceite vegetal diluido también en cuadrúplica.
Coloque la microplaca en la campana de humos en un calentador de bloque seco precalentado a 55 grados Celsius durante 20 a 30 minutos hasta que todo el disolvente se haya evaporado. Retire la microplaca del bloque de calefacción y déjela enfriar a temperatura ambiente. Luego, agregue 30 microlitros de alcohol isopropílico a cada pozo y mezcle en pipeteando arriba y abajo.
Asegúrese de que todos los canales de pipeta están mezclando la solución y resuspendiendo los lípidos, produciendo un líquido verde homogéneo. Ahora, agregue 200 microlitros de un microgramo por mililitro una solución roja del nilo a cada pozo, y entumece hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, agregue 20 microlitros de 50% de solución de lejía a cada pozo, y entumegue hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar bien.
Deje la placa para incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lea la florescencia en las muestras cada cinco a 10 minutos a 530 nanómetros de excitación, emisión de 575 nanómetros, con cortes automáticos establecidos en 570 nanómetros hasta que la señal de las muestras de algas se estabilice. Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de densidad óptica de algel a 550 nanómetros OD.
Los cultivos de control se cultivaron en un nuevo anate NH4 medio. El tratamiento uno, es co-cultivos auxenochlorella protothecoides y azospirillum brasiliense cultivados en medio NH4 innato fresco. El tratamiento dos, es un A.Protothecoides azinic cultivado en medio innato NH4 complementado con 50 miligramos por mililitro IAA, que inhibió completamente el crecimiento de algas.
Tratamiento tres, es azinic A.Protothecoides, cultivado en medio gastado de A.Brasilienes. Las curvas de crecimiento muestran cultivos de auxenochlorella protothecoides entran en crecimiento logarítmico tardío a las 120 horas. Aquí se muestran curvas de corelación entre la densidad óptica a 550 nanómetros y la concentración final de peso seco, utilizando un ajuste polinomio de segundo orden.
Por último, la coloración se puede aplicar a los datos de densidad óptica del curso de tiempo para obtener una curva de crecimiento de peso seco. Los mismos tratamientos se utilizan aquí, excepto que la clorella sorokiniana se cultiva en lugar de auxenochlorella protothecoides. Por porcentaje de lípido neutro de peso seco obtenido en el ensayo de lípidos neutros se correlaciona bien con el contenido de glicerol de tríos en una placa de cromatografía de capa delgada correspondiente.
A diferencia de A.Protothecoides, el tratamiento con IAA no inhibió el crecimiento de C.Sorkiniana. Después de la extracción de lípidos de las algas, el palet celular restante se puede analizar para su contenido de almidón y pared celular, proporcionando una imagen más detallada de los productos de almacenamiento de energía dentro de la célula. Los métodos descritos aquí han permitido nuevos descubrimientos en el campo de los biocombustibles de algel y el tratamiento de aguas residuales.
Específicamente, Este sistema se ha utilizado para entender mejor cómo las bacterias influyen en el crecimiento de algel.
