Este proyecto fue apoyado por el subsidio 1R03MH08127-01 y 7R03MH08127-02 de los NIH para P. Li, y por los fondos de IMPACTO del Departamento de Medicina de la UAB a Q. Li. El apoyo del Fondo Molette y la Universidad de Auburn es apreciado. También agradecemos a las asistencias técnicas de la Sra. Pulin Che y el Sr. Volodymyr Musiienko durante el transcurso de la obra.

1. Células, Virus y el antiviral compuestos <ol><li> Mantener células BSR, un derivado de riñón de hámster bebé (células BHK) 10, en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera fetal al 5% (FCS), 100 U de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Para los tres ensayos, las células de la placa en DMEM con 1% de FCS, 100 U de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, como optimizado previamente 5. Este medio se conoce como medio de ensayo para todos los tres ensayos. </li><li> Incubar todas las células en la incubadora a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad. </li><li> La placa-purificar y propagar el tipo 10 BTV (BTV-10) como se describió previamente 8. Diluir BTV-10 en medio de ensayo para cada uno de los ensayos designados. </li><li> Disolver todos los compuestos de prueba en DMSO para formar una acción con la concentración a 10 mM. Guarde los stocks a -20 ° C. </li><li> Diluir compuestos a concentraciones deseadas usando medio de ensayo para el designadod ensayos 2. </li></ol> 2. Ensayo basado en la CPE Utilizando Kit CTG <ol><li> Semilla células BSR en una microplaca de 384 pocillos (negro, formato de 16 x 24) a través de MicroFlo seleccione dispensador. La densidad de siembra es de 5.000 células / pocillo, y el volumen de siembra es de 20 l para el análisis de eficacia antiviral. </li><li> Se incuban las células durante 2-3 horas hasta que las células obtienen adherente a la placa de fondo. </li><li> Añadir compuesto antiviral con una concentración final de 10 mM a cada pocillo. Mezcle completamente. </li><li> Diluir BTV a título deseado y añadir 5 l BTV con denotado MOI a cada pocillo. Para el control del pozo, añadir 5 l de medio de ensayo. Se incuban las células infectadas durante 72 horas a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad. </li><li> En 72 hpi, descongelación y equilibrar tampón CTG CTG y el sustrato liofilizado a temperatura ambiente antes de su uso. Reconstituir la solución homogénea reactivo CTG mezclando el liofilizado de enzima / sustrato y el reactivo tampón de acuerdo con ªe instrucciones del fabricante. </li><li> Equilibrar las placas de ensayo a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Añadir un volumen igual (25 l) de reactivos CTG a cada pocillo un dispensador. Después de incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad, medir señales de luminiscencia usando un lector de multi-modo con un tiempo de integración de 0,1 segundos. </li></ol> 3. Ensayo de dosis-respuesta <ol><li> Seed células BSR en una microplaca de 384 pocillos (negro; formato de 16 x 24) a través de un dispensador, con una densidad de siembra de 5000 células / pocillo en un volumen de siembra de 20 l para el ensayo de eficacia antiviral y 25 l para el ensayo de citotoxicidad, respectivamente . </li><li> Se incuban las células durante 2-3 horas a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad hasta que las células son bien unido a la placa. </li><li> Proceso de ensayo en una zona de cuarta parte de la placa de 384 pocillos para cada compuesto (equivalente a una placa de 96 pocillos), como se muestra en la Tabla 1. Asignar ocho réplicas para cada concentraciónen un único ensayo. Asignar la primera columna como el control positivo sin la adición de compuesto y el virus, y la última columna (12 ª) como control negativo mediante la adición de virus sólo sin compuestos. </li><li> Diluir compuestos a 50 mM en medio de ensayo y añadir a la columna de la 2 ª a 20 l / pocillo para el ensayo de eficacia antiviral. Mezclar el compuesto cinco veces usando 8-canal de pipeta semi-automática a una concentración de 25 mM. </li><li> Usando la pipeta semiautomática de 8 canales, transferir 20 mezcla l en la columna 2 ª a la siguiente columna (3 º), mezclar bien hasta formar una concentración de 12,5 mM. Repita este proceso mediante la transferencia de 20 l de mezcla de la columna 3 ª a la siguiente columna (4 ª) para formar otra dilución de dos veces con una concentración de 6,25 mM. Repita esta dilución en serie de dos veces hasta que la columna de la 11 ª. Aspirar y desechar 20 l de la mezcla en la columna 11 º después de añadir y mezclar el borradoround. </li><li> Añadir BTV-10, basado en MOI de 0,01, a cada pocillo de la columna 2 a la columna 11 con un volumen de 5 l / pocillo. Después de añadir el virus, la concentración de compuesto final en cada columna debe ser: 20 M en la columna 2, 10 mM en la columna 3, y continuó con una dilución de dos veces a la columna 11 con una concentración final de 0,04 mM. </li><li> Añadir 5 l de medio a la columna 1 como célula sólo de control (positivo) y 5 l / pocillo de BTV a la columna 12 como infección por el virus sólo de control (negativo). </li><li> Diluir compuestos a una concentración inicial de 200 mM para el ensayo de citotoxicidad. Del mismo modo, añadir 25 l / pocillo de compuesto a la columna 2 y 5x mezclado con pipeta semi-automático de 8 canales a una concentración de 100 mM. No agregue BTV. </li><li> Llevar a cabo la dilución serie de dos veces por aspiración 25 l de la columna 2 a la columna vecina 3, y continuó hasta la última columna (12 º). En la columna 12, después de la mezcla, aspirado y desechar 25 l de mezcla. La concentración final en la columna 2 debe ser 100 M y la columna de la 12 ª debe estar en 0,2 mM. La columna 1 es el único control de células. </li><li> Para ambos ensayos de eficacia y de citotoxicidad antivirales, incubar las placas a 37 ° C, con 5% de CO 2 y 80-95% de humedad durante 72 horas después del tratamiento. Medir la viabilidad celular utilizando el kit de CTG como se describió anteriormente (protocolo de los pasos 2.5 a 2.7). </li></ol> 4. Time-of-Adición (TOA) Ensayo <ol><li> Células BSR Semilla de la columna 1-24 en una microplaca de 384 pocillos (negro, en formato de 16 x 24) a través de un distribuidor a 5.000 células / pocillo y el volumen de siembra es de 15 l / pocillo. </li><li> Para cada compuesto, utilizar todos los veinticuatro columnas con ocho réplicas para cada punto del tiempo en un medio de la placa de 384 pocillos (Tabla 2). Asigne la columna 1 como células único control por adición de 10 l / pocillo de medio de ensayo. Marcar la columna 24 como infección por el virus sólo de control (control negativo) mediante la adición de 5 l / pocillo de medio de ensayo unavirus de D 5 l / pocillo a una MOI de 0,01 a un volumen final de 25 l / pocillo. </li><li> Seleccione las columnas de números pares de la columna 2-22 columna de evaluación de la eficacia como antiviral a diferentes horas después de la infección (hpi). En estas columnas, infectar las células con 5 l / pocillo BTV a MOI de 0,01. En diferente hpi, también añadir 5 l / compuesto bien diluida a cada pocillo para formar un volumen final de 25 l / pocillo. Para el denotados -2 y -1 hpi añadir compuesto de células BSR antes de la infección por el virus. Para 0 hpi, añadir el compuesto y BTV a la cultura al mismo tiempo. </li><li> En paralelo, designar las columnas impares de la columna 3-23 como compuesto sólo controla, de los cuales el compuesto se añadieron a diferentes puntos de tiempo designado como (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). En estas columnas, se añade medio / pocillo de ensayo 5 l y 5 l / pocillo diluida compuesto para formar un volumen final de 25 l / pocillo. </li><li> Después del tratamiento, las células se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 con 80-95% de humedad. </li><li> Determinar la viabilidad celular a 72 hpi usando el kit de CellTiter-Glo como se ha descrito previamente (protocolo de los pasos 2.5 a 2.7). </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Procesar todos los datos primero usando el software adecuado en la empresa sobre la base de las señales luminiscentes obtenidas mediante el lector multi-modo. Determinar el valor medio (Media), desviación estándar (STDEV) para cada tratamiento, así como las variaciones de los coeficientes (CV), que requiere un valor no mayor que 10%. </li><li> Transfiera los datos procesados ​​del software anterior a una herramienta de software bioestático y gráfica. Llevar a cabo el análisis de regresión no lineal para determinar los valores de CE 50 y CC 50. </li></ol>

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Para la identificación inicial de los accesos antivirales, uno de los pasos principales para el descubrimiento y desarrollo de fármacos antivirales es para desarrollar ensayos robustos, que incluye la selección de un marcador cuantificable, el desarrollo de un protocolo simple, la obtención de señales suficientes y menos de 10% de CV. La mayoría de las pantallas bioquímicos o basados ​​en células están diseñados para proporcionar un punto de partida química basado en el, ensayo simple y de bajo costo más...

BTV es un virus ARN de cadena doble-prototipo en el género Orbivirus, familia Reoviridae. BTV es una de las enfermedades más importantes de los animales domésticos, incluyendo ovejas, cabras, ganado y otros animales domésticos, con la pérdida de $ 3 mil millones / año en todo el mundo 1,2. La exótica serotipo BTV es un patógeno animal importante que aparece en el &quot;USDA Alta Consecuencia Ganado patógenos.&quot; Recientemente, la re-emergente de BTV ha causado un brote importante de la enfermedad en el ganado vacuno y ovino en varios países de todo el norte de Europa 3,4. Como resultado de su importancia económica y como un sistema modelo, BTV ha sido objeto de extensos estudios moleculares, genéticos y estructurales, y varios se han desarrollado vacunas. Sin embargo, debido a la falta de ensayos adecuados para el descubrimiento de fármacos antivirales, no hay antivirales disponibles contra BTV. En una selección de alto rendimiento reciente campaña (HTS) usando BTV como el sistema modelo, developed, optimizado y validado un ensayo basado en CPE para identificar potenciales antivirales de amplio espectro contra los arbovirus 5. Ensayo basado-CPE es un ensayo bien reconocido que se ha utilizado en el descubrimiento de fármacos antivirales contra un número de virus que induce una rápida y observables CPE / apoptosis 5-7. En nuestro sistema, después de la infección BTV, el ECP es evidente en las células de vertebrados, incluyendo células HeLa, BSR, y HEK 293T 8. CPE inducida por BTV podría controlarse y cuantificarse utilizando diversos métodos de detección de la viabilidad celular, incluyendo el kit de reactivo de la viabilidad celular CellTiter Glo (kit de CTG) 9. Este kit determina el número de células viables en cultivo basado en la cuantificación del ATP celular presentado, que señala la presencia de células vivas metabólicamente activas. En condiciones optimizadas, el ensayo basado en CPE que aquí se presenta mostró su viabilidad con la &quot;mezclar y medir&quot; protocolo de un paso, y la flexibilidad con señales luminiscentes estables. Mientras tanto, los compuestos tóxicos Reducing la viabilidad celular se puede excluir en este ensayo basado en CPE. El ensayo basado en CPE mostró su robustez y fiabilidad para el descubrimiento de fármacos antivirales contra BTV, y se ha utilizado para detectar el NIH bibliotecas moleculares de moléculas pequeñas Repositorio (MLSMR), que conduce a la identificación de seis clúster novela de potencial compuesto de plomo antiviral (s ) 5. Cuando un compuesto antiviral potencial ha sido identificado utilizando el ensayo basado en CPE, que tendrá que ser sometido al ensayo de dosis-respuesta de diez concentración para determinar el rango de eficacia antiviral y la citotoxicidad 2. La eficacia antiviral, representada como la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva 50% (CE 50), es la concentración de un fármaco que inhibe a mitad de camino de CPE inducido por el virus entre la línea de base y máxima. La citotoxicidad de los antivirales, es decir, la concentración de la citotoxicidad 50% (CC 50), es la concentraciónde un fármaco que induce 50% de citotoxicidad entre la línea de base y máxima. El índice selectivo (SI), que se denota como 50% de Si (SI 50) se calcula a partir de CC 50 / IC 50 que determina la especificidad de la antiviral contra el CPE inducido por el virus. El IC 50 (o CE 50), CC 50 y SI 50 valores son medidas críticas para determinar si un compuesto antiviral es potente y selectivo para el desarrollo de drogas. Cuando un antiviral no mostró toxicidad manifiesta in vitro, sin embargo, el virus impedido inducida CPE y el ciclo de vida viral productiva, es importante para caracterizar su Ministerio de Agricultura 2. Iniciamos dicha caracterización mediante la realización de ensayo de Toa para determinar el paso posible (s) del ciclo de vida del virus que queda afectada por el antiviral. En general, el compuesto antiviral se añadieron a las células a diferentes tiempos pre-o post-infección de virus. Si se añaden los antivirales a las células infectadas por publicar en su objetivo sTEP durante el curso de la infección, que daría lugar a una menor actividad en comparación con la que se añadió antes de la etapa. Así, el estudio ToAs es fundamental para determinar la eficacia antiviral de un compuesto, y su objetivo potencial, ya sea en el ciclo de vida viral o la maquinaria de acogida que participan en el ciclo de vida viral. Para los tres ensayos, la viabilidad celular se determinó usando el kit de CTG siguiendo las instrucciones del fabricante 5. Este sistema de detección emite señales de luminiscencia adecuados que podrían ser analizados utilizando distintos programas informáticos en la empresa. Cada ensayo se validó y se realiza al menos por triplicado, con ocho réplicas. Para todos los datos obtenidos, tres parámetros, incluyendo valor medio (AVE), desviación estándar (STDEV), y coeficiente de variación (CV) se analizaron para determinar la robustez del ensayo. Una vez que la robustez del ensayo se ha determinado, serán analizados con mayor detalle los datos y se representan utilizando diversos bioestadística y gráficamenteherramientas de c 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Identificar potenciales antivirales contra BTV, hemos desarrollado, optimizado y validado tres ensayos que aquí se presentan. El ensayo basado en CPE fue el primer ensayo desarrollado para evaluar si un compuesto mostró ninguna eficacia antiviral y se han utilizado para cribar gran biblioteca de compuestos. Mientras tanto, la citotoxicidad de los antivíricos también podría ser evaluado usando el ensayo basado en CPE. El ensayo de dosis-respuesta fue diseñado para determinar el rango de eficacia para el antiviral seleccionado, es decir, la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva (CE 50), así como su gama de citotoxicidad (CC 50). El ensayo ToAs fue empleado para el estudio inicial el Ministerio de Agricultura para determinar el mecanismo subyacente de los nuevos antivirales durante BTV ciclo de vida viral o el posible efecto en la maquinaria celular del huésped. Estos ensayos son de vital importancia para la evaluación de la eficacia antiviral en el sistema de cultivo de células, y se han utilizado para nuestras investigaciones recientes conducirción a la identificación de una serie de nuevos antivirales contra BTV.

1. Eficacia antiviral del compuesto El ensayo CPE basado en células fue desarrollado, optimizado y validado in vitro utilizando el kit de CTG a base de luminiscente para identificar nuevos antivirales contra BTV como se ha descrito previamente 2,5. El ensayo de respuesta de diez dosis fue empleado para reflejar la eficacia antiviral y la citotoxicidad de un compuesto de plomo identificado por la medición del número de células metabólicamente viables en cultivo ...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus at JoVE.com

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados.

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K vistas.  University of Alabama at Birmingham.  Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados. 

Video: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

La inmunofluorescencia para supervisar la captación celular de lactoferrina humana y su Asociado actividad antiviral contra el virus de hepatitis C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...