Este trabajo fue financiado por una Beca de Investigación Wellcome Trust Principal I. Davis.

1. Drosophila antes de la preparación para la disección (Según E. Gavis, la Universidad de Princeton) <ol><li> Deseche los adultos a partir de una botella con baja densidad sin semillas y la transferencia de la botella a 25 ° C antes de su experimento. Una vez que nuevos adultos han comenzado a surgir, esperar dos días. </li><li> Tomar un vial que contiene aproximadamente 10 ml de la mosca de alimentos sólidos y agregar 0,5-0,7 gramos de levadura seca (ver tabla) en un ángulo de 45 grados. No cubra toda la superficie del alimento mosca con levadura. </li><li> Añadir unas cuantas gotas de agua a la levadura, suficiente para hidratar (Figura 1A). Coloque el vial a 45 grados y permitir que unos 3 minutos para que la levadura para absorber el agua (Figura 1B). </li></ol> Nota: Como alternativa, mezcle una levadura pega en un recipiente aparte y añadir la pasta para el vial con una espátula. <ol start="4"><li> Anestesiar las moscas en el vial mediante la inyección de gas CO 2. Cuando se deja de mover, inclinar las moscas inconscientes sobre el CO 2 </sub&gt; mosca plataforma para la clasificación (fig. 1C). </li><li> Aislar 10-15 hembras y 5 machos del genotipo deseado bajo un microscopio de disección con un pincel de punta fina (Figura 1D). Los machos son evidentes por la presencia de cláspers, una estructura que sobresale oscuro, en su posterior. </li><li> Añadir moscas seleccionados al vial yeasted (Figura 1E). Lugar a 25 ° C durante 24-60 horas. Incubar durante períodos de tiempo más cortos para un mayor porcentaje de jóvenes a mediados de cámaras de la etapa de huevo y períodos más largos de tiempo para fines de cámaras de la etapa de huevo. </li></ol> 2. Drosophila disección ovario <ol><li> Coloque una pequeña gota de aceite en un halocarbono N º 1,5, 22 x 50 mm cubreobjetos (Figura 2A). Establecer el cubreobjetos preparada para el lado donde no estará en el camino. </li><li> Anestesie las moscas en la yeasted vil mediante la inyección de gas CO 2 y la punta en una plataforma de CO 2. </li><li> Utilice bien afilados de nariz unas pinzas para agarrar un individuo gordo hembra en la parte anterior del abdomen (no entre los díase el abdomen y el tórax) (Figura 2B-C). </li><li> Mantenga a la hembra con las pinzas y ver en un microscopio de disección, aproximadamente 2-3 cm por encima del cubreobjetos preparada. </li><li> Aún sosteniendo en la parte anterior, utiliza un segundo conjunto de fórceps para extraer el tejido en el extremo posterior de la hembra (Figura 2D). Nota: tejido intestinal generalmente se tire a cabo con el extremo posterior. Limpie el tejido extraído de las pinzas. </li><li> Mientras mantiene la hembra en la parte anterior, utilice las pinzas para apretar suavemente limpiadas o un masaje en el abdomen, trabajando desde la parte anterior hacia la parte posterior. Masajea el abdomen de la misma manera como la eliminación de pasta dentífrica desde el extremo de un tubo. </li><li> Dos estructuras opacas grandes serán empujados desde el abdomen y la palanca en el extremo de la pinza (Figura 2E-F). Estos son los ovarios pareados. </li><li> Toque los ovarios en el aceite de halocarbonos en la diapositiva a continuación. </li><li> Repita la disección de 1-2 veces para dar un total de 4-6 ovarios en el aceite en el cubreobjetos (Figure 2G). </li></ol> 3. Ovarioles aislamiento Nota: Cada ovario contiene cerca de 16 ovarioles compuestas de 6 a 10 cámaras de huevos de las diferentes etapas dispuestas como cuentas de un collar 10. Nota: Antes de aislar los ovarioles, ajustar la fuente de luz en el microscopio de disección, para que la iluminación afecta a un ángulo bajo a la muestra. Esto da contraste a la muestra y permite la visualización de las cámaras de huevo jóvenes etapa. <ol><li> En el aceite, separar los dos ovarios mediante la eliminación del tejido de conexión en el extremo posterior (etapas de edad) con fórceps cerrada (Figura 3A). </li><li> Orientar un ovario individual con las más antiguas etapas en la etapa de la izquierda y más joven de la derecha. Las cámaras de la etapa juvenil de huevo en el ovario son transparentes y constituyen el extremo más puntiagudo del ovario. </li><li> Con un par de pinzas en la mano dominante, agarre suavemente la parte posterior de un ovario, de preferencia por los restos de ºe tejido conectivo. Mientras sostiene el ovario en su lugar con las pinzas, utilice una sonda de disección (o una aguja de tungsteno) para desentrañar ovarioles individuales (Figura 3B-D). </li></ol> Nota: ovarioles individuales se rompe entre las etapas de los jóvenes (germario a la etapa 10), como las etapas más antiguas son demasiado grandes para ser separado del ovario completo. Nota: La punción un oocito etapa tardía con la sonda de disección se traducirá en el citoplasma fugas en el aceite y hacer la extracción de ovarioles individuales muy difícil. Si un óvulo última etapa se perfora, se mueven a un ovario fresco. <ol start="4"><li> Una vez que el ovariola está libre de los ovarios, el uso de la sonda de disección para arrastrarlo al centro de la gota de aceite y orientar en la orientación deseada para el experimento. Nota: ovarioles en el aceite se asiente y se adhieren al vidrio. </li><li> Repita este proceso (3.3 a 3.4) hasta que no haya 15-25 ovarioles individuales. Nota: Esto puede requerir la disección de multípara-le ovarios. Todo el proceso debe tener menos de 15 minutos. </li></ol> Nota: Es aconsejable para diseccionar cada uno de los ovarios de varias moscas en lugar de la disección de los ovarios de un menor número de moscas para aumentar el número n de moscas para el experimento. Nota: El manejo brusco de la ovariola dará lugar a los ovocitos no saludables y pueden dar lugar a artefactos en el experimento. Nota: Los ovocitos comenzará a mostrar cambios fenotípicos debido al estrés 40 minutos después de ser diseccionado por el ovario (comparar Figura 7E a la F). <ol start="6"><li> Una vez ovarioles están en una orientación adecuada (Figura 3E), utilice la sonda de disección y pinzas cerradas para mover el exceso de tejido ovárico del aceite. Este material puede ser borrado de las pinzas en una toalla de papel. </li></ol> 4. De aislamiento individuales finales cámaras estado de huevo (De acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton) <ol><li> Con un par de pinzas en el dominPor la hormiga, sujete la parte posterior de un ovario aislado, preferentemente por los restos del tejido conectivo. Mientras sostiene el ovario en su lugar con el fórceps, introducir la sonda de disección en el extremo posterior del ovario cerca de las pinzas (Figura 4A). Evite perforar las cámaras de huevos mediante la inserción de la sonda entre finales de cámaras de la etapa de huevo. </li><li> Tire de la aguja de disección a través del ovario hasta que sale en las cámaras de huevos en fase inicial (Figura 4B). Cuando se hace correctamente, la sonda se eliminará el tejido conectivo y la celebración de las finales de ovarioles cámaras de huevo etapa en su lugar. </li><li> Repita el paso 4.2 hasta que los ovarioles se extienden sobre el cubreobjetos. Nota: Cuando las cámaras de huevo ya no están apilados uno encima de otro, este paso es completa. </li><li> Utilizando la sonda de disección, separar los oocitos finales para permitir la formación de imágenes fácil (Figura 4C). </li></ol> Nota: La punción de un ovocito, mientras que la disección de finales de cámaras de la etapa de huevo no es tan condenando al igual que con la disección de iovarioles INDIVIDUALES para los más jóvenes. Nota: Para la etapa de huevo 14 cámaras, utilice las pinzas para agarrar los apéndices dorsales para la orientación. 5. Inyección de la preparación Nota: Para la inyección de ovocitos etapa intermedia, orientar la ovarioles perpendicularmente al eje longitudinal de la hoja de la cubierta. <ol><li> Encienda el microscopio de imagen [en nuestro caso un Core DeltaVision de precisión aplicada] y cargar los ajustes de imagen apropiadas (Figura 5A-B). </li><li> Encienda el aparato de inyección (Figura 5). </li><li> Cargar la aguja de inyección con una punta de carga (Figura 5D-E). Soluciones para ser inyectados se deben centrifugar brevemente a alta velocidad para evitar los depósitos que podrían bloquear la aguja de inyección. </li><li> Coloque la aguja de inyección de carga en el inyector. Tenga cuidado de no romper la aguja (Figura 5F). </li><li> Para ayudar con agujas destapan, coloque un pequeño trozo de vidrio de 2x10 mm a partir de un corte o una quebrada cubreobjetost un lado de la gota de aceite que contiene los ovarioles. Asegúrese de que este fragmento de vidrio está cubierto de aceite. Este vidrio servirá para embestir al extremo de la aguja en su contra por romper o destapar la aguja. </li></ol> 6. La inyección de ARN fluorescente Antes de comenzar: Establecer el aparato de inyección y micro-manipulador tales controles que la aguja de inyección se coloca sobre el centro del campo de visión. <ol><li> Montar la muestra que se inyecta en la platina del microscopio. </li><li> Seleccione el objetivo de 20x. Superiores o inferiores objetivos de ampliación también se puede utilizar. </li></ol> Nota: Si utiliza una etapa automatizado con capacidad de punto de visita es recomendable para marcar toda la etapa de 8-9 ovocitos para la inyección antes de empezar. Esto permite por visitar fácil y la inyección de oocitos seleccionados. <ol start="3"><li> Baje la aguja de la inyección hasta que toque el aceite. Centro de la punta de la aguja sobre la lente del objetivo. </li><li> Vueltafrente a las luces de la habitación y enciende la luz brillante del campo del microscopio. Seleccione el primer punto (ovocitos) en la lista de los puntos marcados. Mientras mira a través de los oculares, se centran en el ovocito (Figura 6). </li><li> Baje la aguja de forma manual hasta que esté en el mismo plano de enfoque como el ovocito y el próximo visible para el ovocito. </li><li> Usando los controles de manipulador, mover la punta de la aguja de la inyección hasta que esté en el interior del ovocito. Un movimiento rápido apuñalar a menudo más que un avance lento. Una vez dentro, expulsar un pequeño volumen de la aguja y evaluar los efectos visuales, repetir según sea necesario. Si la inyección es correcta, el citoplasma en el interior del oocito serán desplazados, si esto no es aparente, la repetición. No es necesario que la imagen de la fluorescencia para determinar si el material ha sido inyectada. Después de la inyección, retire la aguja desde el interior del ovocito (Figura 6B-G). </li><li> La cantidad precisa de fluido que se inyecta es difícil de cuantificar. Para aumentar el volumen inyectado, adyuª de la presión o el tiempo del pulso de inyección, romper la punta de la aguja para aumentar la apertura de un poco o usar pulsos repetidos de la inyección. </li></ol> Nota: El proceso de inyección completa debe tener menos de 10 segundos cuando se ejecuta correctamente. Amplia punzante o persistentes con la aguja en su interior de los ovocitos dará lugar a graves daños a la cámara de huevos. <ol start="8"><li> Antes de seleccionar el oocito marcado siguiente, elevar la aguja de inyección suficientemente alta en el aceite para no ponerse en contacto con oocitos otros en la ruta del viaje. </li><li> En el ovocito nuevo, repita el paso 6.6. Continúe de esta manera hasta que todos los ovocitos necesarios se inyectan. </li></ol> Nota: Si se comete un error mientras se inyecta, pasar a la siguiente marca de ovocitos. No pierda el tiempo en los ovocitos dañados. Nota: La aguja puede obstruirse durante una sesión de la inyección. En este caso, mover la aguja adyacente a la pieza rota de vidrio en el aceite sobre el cubreobjetos. Ingenioh, el vidrio y la aguja en el mismo plano focal, suavemente incrustar la aguja en el vaso (Figura 6H). Prueba de que la aguja se unclogged pulsando el botón de inyección y ver si cualquier líquido sale de la punta de la aguja. <ol start="10"><li> Cuando todos los oocitos se han inyectado, mover manualmente la aguja hacia arriba, fuera del aceite y orientarlo hacia fuera de la trayectoria del haz para el microscopio. Asegurarse de que se trata en una orientación segura, para evitar daños en los ojos. </li></ol> Nota: Si un largo período de tiempo transcurrido entre el aislamiento de huevos de cámara y la inyección de ovocitos, óvulos, será difícil para inyectar y muestran cambios fenotípicos asociados con el estrés. Problemas similares pueden surgir con el manejo brusco de los ovocitos o la inyección de volúmenes de exceso (compare las figuras 6I, J, K). 7. Vivir el diseño experimental de imágenes <ol><li> Seleccione el ovocito inyecta por primera vez en la lista. Prueba de que la inyección era el interior del ovocito por la imagen un fotograma de la fluorescencia (unas en la Figura 6G). </li><li> Configure los parámetros experimentales, entre ellas: la longitud de onda de excitación, la trayectoria de emisiones, el tiempo de excitación, Z-pila y el tiempo entre las colecciones. Nota: Para obtener más información sobre esto, vea Parton R., et al. (2010) 2. </li><li> Reúne el conjunto de datos. </li></ol> 8. Los resultados representativos In vitro sintetizado Alexa-546 GRK ARN se inyecta en un Me31B :: GFP huevo cámara (Figura 7A). El ARN se localiza en la parte anterior dorsal del oocito y forma un tapón alrededor del núcleo (Figura 7B). Para más ejemplos de la localización del ARN ver MacDougall N., et al. (2003) 11. Ovocitos etapa de mediados y finales que expresan la proteína fluorescente etiquetados (Tau-GFP, Figura 7C) o los sistemas de etiquetado de ARN (GRK * mCherry, la figura 7D) se pueden obtener imágenes sin inyección. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> Figura 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Figura 7.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

<html> Imágenes de células vivas es un ensayo de gran alcance para el examen de los procesos celulares en tiempo real. Además de la simple observación de campo brillante, la adición de marcadores fluorescentes a las proteínas y ARN de interés ha llevado a muchos avances. Aquí hemos descrito un protocolo de oocitos de imagen de vida individuales que pueden ser utilizados en combinación con los ensayos genéticos y bioquímicos. En este protocolo, también se explica cómo manipular experimentalmente los ovocitos mediante una inyección de vida. Existen muchas posibilidades para el material a inyectar, incluyendo sintetizado in vitro del ARN marcadas fluorescentes para ensayar la capacidad de una estructura secundaria de ARN directa localización (bola y Davis, no publicado) y anticuerpos que inhiben la función de las proteínas 6. El trabajo futuro es probable que vea la introducción de componentes de etiquetado y otras maquinaria celular de ovocitos de vida que permitan a los mecanismos moleculares a ser probado. t &quot;&gt; Para preservar la viabilidad y la salud de los tejidos es esencial cuando se trabaja con células vivas. En este protocolo, señalamos una serie de medidas que pueden conducir al estrés de la cámara de huevos. Por ejemplo, a pesar de petróleo fue superior para obtener imágenes, la cultura extendida en el aceite puede provocar estrés en la cámara de huevos. Esto puede ser fácilmente controlados en la exposición de campo claro mediante el examen de la morfología nuclear y la posición, la membrana de los ovocitos que se distorsionan y la ampolla bajo estrés (comparar Figura 7E (átona) para Figure7F ( hizo hincapié en)). Etapa 9 cámaras de huevos muestran la localización del ARN y la migración de borde de la celda 12 horas sobre múltiples. Sin embargo, una etapa de 7.8 cámara de huevos comenzará a mostrar efectos negativos en el aceite de carbón de halo después de aproximadamente 40 minutos de los ovarios que son removidos de la de sexo femenino. cámaras de última hora de huevo, estadio 11 a 14, pueda desarrollarse con normalidad, ya sea en aceite o medios acuosos debido a la secreción de la cáscara del huevo de las células de los folículos en estas 13 etapas. Ha sido reported que la adición de insulina al medio de insectos acuosa puede mantener la etapa 9 ovocitos para un máximo de 6 horas y 14 germaria hasta 14 horas 15. En todos los casos, las maniobras agresivas de la cámara de huevos debe evitarse, ya que hace hincapié en los ovocitos y reduce su viabilidad. Imagen menos cámaras de huevos y el cuidado para el tratamiento de cada uno con cuidado es la mejor manera de asegurar la viabilidad óptima.

Las herramientas utilizadas en la disección debe ser limpio, pero no necesitan ser esterilizados en autoclave. Limpie las herramientas con EtOH y dejar que se sequen antes de empezar. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Punta de pincel fino pintura (Artistas Sable, redondo, de tamaño 00 o 0) </td><td> Disponible en la mayoría de los medios materiales de arte </td><td></td><td> Un cepillo de buena calidad es importante </td></tr><tr><td> Halocarburos Products Corporation, de la Serie 95 </td><td> Halocarburos Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Distribuidor europeo: Solvadis (GMBH) Asegúrese de oxigenar haciendo burbujear aire a través del aceite. </td></tr><tr><td> Cubreobjetos-No. 1,5, 22 x 50 mm </td><td> Internacional-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm-400-070T MNJ </td><td></td></tr><tr><td> Dumont N º 5 - Dumostar </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; punta también es bueno, pero más frágil </td></tr><tr><td> La disección de la sonda </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de CO2 </td><td> Disponible a través de <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Una división de Genesee Científico) </td><td> 59-114 (789.060 Dutscher) </td><td> Distribuidor europeo: www. dutscherscientific. com</a> / También es relativamente fácil de construir tu propia mosca almohadillas </td></tr><tr><td> KIMCARE </td><td> Kimbery Clark-KIMCARE-médicos toallitas </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio-DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Burleigh Micromanipuladores Dinámica de Grupo Lumen inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, Canadá L5N 6H7 </td><td> Burleigh PCS-5000 series, el TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Anteriormente Exfo) </td></tr><tr><td> Aparatos de inyección </td><td> Tritech Research, Inc. 2961 Ave. los Veteranos Los Angeles, CA 90064 </td><td> Minj-1 </td><td> Modificado con un soporte para tomar Eppendorf Femptotips </td></tr><tr><td> Aguja de inyección </td><td> Eppendorf estéril Femtotips I y II </td><td> 930000043 </td><td> Puntas diferentes son mejores para diferentes aplicaciones </td></tr><tr><td> Cargando consejos 20ul </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Levadura seca activa </td><td> La levadura Fleischmann </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparing individual drosophila egg chambers for live imaging

Imágenes de células vivas es una importante técnica se aplica a una serie de tejidos de Drosophila usados ​​como modelos para investigar temas como la especificación del eje, la diferenciación celular y organogénesis 1. La correcta preparación de las muestras experimentales es crucial, a menudo descuidado, paso. El objetivo de la preparación es para garantizar la relevancia fisiológica y establecer las condiciones óptimas de imagen. Para mantener la viabilidad del tejido, es fundamental para evitar la deshidratación, el deterioro de la hipoxia, sobrecalentamiento o el medio 2. La cámara de Drosophila huevo es un sistema bien establecido para examinar las cuestiones relativas, pero no limitado, a patrón del cuerpo, la localización del mRNA y la organización citoesquelética 3,4. Para cámaras de huevo primeros y mediados etapa, el montaje en el aceite de hidrocarburo halogenado es bueno para la supervivencia en que permite la libre difusión de oxígeno, evita la deshidratación y la hipoxia y tiene excelentes propiedades ópticas para microscopía. Imenvejecimiento de las proteínas fluorescentes es posible mediante la introducción de transgenes en la cámara de huevos o de inyección física de ARN, proteínas marcadas o anticuerpos 5-7. Por ejemplo, la adición de MS2 construcciones en el genoma de los animales permite la observación en tiempo real de ARNm en el oocito 8. Estas construcciones permiten en el etiquetado de ARNm in vivo mediante la utilización de la interacción MS2 bacteriófago bucle ARN vástago con su proteína de la cubierta 9. Aquí, se presenta un protocolo para la extracción de los ovarios, así como aislar ovarioles individuales y las cámaras de huevos de la hembra de Drosophila. Para una descripción detallada de Drosophila oogenesis véase Allan C. Spradling (1993, reeditado en 2009) 10.

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Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Cámara de huevo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de localización del mRNA. Con el fin de capturar los eventos dinámicos que subyacen a los procesos de localización, imágenes de alta resolución rápida de tejido vivo se requiere. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y la imagen de las muestras en vivo con una interrupción mínima.

Preparación Individual Drosophila Huevos Cámaras de Imágenes en directo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

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Biology

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

19.1K vistas.  University of Oxford. La Drosophila Cámara de huevo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de localización del mRNA. Con el fin de capturar los eventos dinámicos que subyacen a los procesos de localización, imágenes de alta resolución rápida de tejido vivo se requiere. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y la imagen de las muestras en vivo con una interrupción mínima.

Video: Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Investigación

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

La recolección y preparación de Drosophila Los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...