Los autores agradecen a Reiner Schultheiss y Wolfgang Schaden por su inspiración para este modelo. También agradecemos cristiana Dorfmüller por sus enormes esfuerzos todos los tiempos para apoyar nuestra investigación. Muchas gracias a Robert Göschl y Hans Hohenegger de realización técnica cuidadosa de nuestras ideas!

Ethical permiso Después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes, los cordones umbilicales se obtuvieron de cesárea en el Departamento de Ginecología para el aislamiento de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). El permiso fue dado por el comité de ética de la Universidad Médica de Innsbruck (no. UN4435). 1. Prepare la bañera de agua IVSWT <ol><li> Preparar 3,5 L de agua del grifo en un depósito adecuado. Necesita ser calentado a 37 ° C (véase el Protocolo 6) de agua. </li><li> Llene el agua en el baño de agua hasta que el nivel del agua es de aproximadamente 3 cm por debajo del borde. Mente para cubrir completamente la membrana con agua. Esto requerirá aproximadamente el preparado 3.5 L. </li><li> Conectar el sensor de temperatura a la fuente de alimentación. </li><li> Ponga el sensor en la conexión prevista en la pared del fondo del baño de agua. </li><li> Conectar el calentamiento a la fuente de alimentación del sensor de temperatura. No hacer esto sinagua en el baño como el calentador se derretiría el plexiglás. </li><li> Espere hasta que el agua alcance una temperatura estable de 37 ° C. Revuelva el agua regularmente con algún tipo de palo para garantizar una temperatura constante durante todo el baño de agua. </li></ol> 2. Preparar Células y frascos de cultivo <ol><li> Se siembran las células durante la noche a la densidad deseada en frascos de cultivo T25 o cultivar las células en los matraces directamente hasta que han alcanzado la confluencia deseada. </li><li> Antes del experimento, alinee los frascos verticalmente. </li><li> Llene los frascos de cultivo con medio de cultivo hasta justo por debajo de sus cuellos. No llene demasiado medio en los frascos como medio de contacto en el cuello o la tapa de cierre se contaminaría. </li><li> Tornillo de los frascos con tapas de sólidos sin filtros para evitar la contaminación del agua. Cuenta que el agua en el baño y el baño en sí no son estériles. </li><li> Selle los tapones con Parafilm antes de la inserción en el baño de agua. </li> &lt;li&gt; Fijar la cultura frascos sellados en el soporte suministrado. </li><li> Inserte frasco fija en el baño de agua. Tenga cuidado de que el medio del matraz de cultivo de células es a la misma altura que el centro de la membrana de la onda de choque del aplicador. Una línea en el lado de la bañera le guía. </li></ol> 3. Definir los parámetros de tratamiento <ol><li> Define la distancia entre la fuente de ondas de choque y la muestra. Identificar los parámetros de tratamiento perfectos por la realización del experimento piloto parámetro hallazgo como se describe en la Figura 6. </li><li> Elija los parámetros de tratamiento adecuado (densidad de flujo de energía, frecuencia) en el dispositivo de ondas de choque. Una vez más, consulte la Figura 6. </li></ol> 4. Aplicación de la onda de choque <ol><li> Ponga cantidades montón de gel de transmisión de ultrasonidos comercialmente disponible en la onda de choque de aplicación, así como en la membrana del baño de agua. Esto es para asegurar el acoplamiento. No hay aire o burbujas de aire deben estar entre el aplicador y la membrana comosería absorber las ondas de choque. </li><li> Conectar aplicador a la membrana y mantenerla estable en el centro de la membrana. Tenga cuidado de que quede alineada horizontalmente. </li><li> Asegúrese de que la posición vertical correcta de la sonda en el interior del baño de agua está en línea con lo señalado el marcado en el lado de la bañera. </li><li> Mantenga centros del aplicador y el establo frasco en una línea horizontal. </li><li> Activar el dispositivo de ondas de choque y aplicar los impulsos mientras se mantiene el matraz de cultivo, así como el aplicador en una posición estable durante todo el procedimiento. </li></ol> 5. Después del tratamiento <ol><li> Tome el frasco de cultivo fuera del baño de agua. </li><li> Seque con toallas de papel comunes. </li><li> Limpiar el matraz con precisión con agentes desinfectantes. </li><li> Retire Parafilm sellado y la tapa. </li><li> Pipetear la mediana dentro de los frascos a tubos centrífugos. </li><li> Centrifugar apropiadamente. Parámetros de centrifugación dependen del tipo de célula utilizado, <em&gt; Por ejemplo. para las HUVEC, utilizar 290 g a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo celular al matraz. Resuspender el sedimento de células se centrifugó con 2 ml de medio de cultivo celular. Pipetear la suspensión en el matraz. Por lo tanto, fragmentos de células o células que pueden haber sido separados durante el tratamiento no se pierdan. </li></ol> Trampas <ol><li> Preparación así como el tratamiento deben llevarse a cabo en condiciones estériles dentro de flujo laminar para evitar la contaminación del cultivo celular. </li><li> Se recomienda una buena práctica de cultivo de células para evitar la contaminación de las sondas. En particular, la desinfección del exterior de los frascos es muy recomendable antes de ponerlos de nuevo a la incubadora. El baño de agua, así como el interior del agua, no es estéril! </li><li> No conecte el calentador a la fuente de alimentación a menos que el baño de agua se llena con agua para evitar daños a las plexiglás baño construidas. </li><li> Use una cantidad generosa de gel de ultrasonido sobre la apl onda de choqueicator para garantizar el acoplamiento adecuado y la propagación de ondas en el baño. Burbujas de aire de aire e incluso pequeñas absorben ondas de choque! </li><li> Comprobar la posición de las sondas en el interior del baño de agua en relación con el aplicador para asegurar el tratamiento de toda el área de crecimiento. </li><li> No mojar sondas demasiado profundo en el agua para evitar la contaminación. </li></ol>

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	<li>Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shock+waves+on+fracture+healing.">Influence of shock waves on fracture healing.</a> Urology. 39, 529-532 (1992).</li><li>Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+of+nonunion+or+delayed+osseous+union.">Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).</li><li>Schaden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+therapy+for+acute+and+chronic+soft+tissue+wounds:+a+feasibility+study.">Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study.</a> J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).</li><li>Tepek&#246;yl&#252;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+treatment+induces+angiogenesis+and+mobilizes+endogenous+CD31/CD34-positive+endothelial+cells+in+a+hindlimb+ischemia+model:+Implications+for+angiogenesis+and+vasculogenesis.">Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).</li><li>Nishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+markedly+ameliorates+ischemia-induced+myocardial+dysfunction+in+pigs+in+vivo.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.</a> Circulation. 110, 3055-3061 (2004).</li><li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+ameliorates+myocardial+ischemia+in+patients+with+severe+coronary+artery+disease.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease.</a> Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).</li><li>Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-time+non-enzymatic+nitric+oxide+synthesis+from+L-arginine+and+hydrogen+peroxide+induced+by+shock+waves+treatment.">Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment.</a> FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).</li><li>Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+shock+wave+mediates+membrane+hyperpolarization+and+Ras+activation+for+osteogenesis+in+human+bone+marrow+stromal+cells.">Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).</li><li>Mittermayr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+(ESWT)+minimizes+ischemic+tissue+necrosis+irrespective+of+application+time+and+promotes+tissue+revascularization+by+stimulating+angiogenesis.">Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis.</a> Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).</li><li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis.">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La importancia del modelo propuesto para el tratamiento in vitro de la onda de choque es en el hecho de que las ondas pueden propagarse después de pasar el cultivo de células en contraste con los modelos existentes. De este modo, los efectos físicos perturbadores tales como fuerzas de tracción se pueden evitar. El modelo se asemeja más estrechamente las condiciones in vivo que por otros que la aplicación de ondas de sus frascos de cultivo celular directamente. <p class="jove_content"...

Las ondas de choque son ondas de presión sonora que surgen de una súbita liberación de energía, por ejemplo. como un trueno cuando un rayo. En la medicina ondas de choque se han utilizado durante más de 30 años en litotricia para la desintegración de cálculos renales. Desde el hallazgo incidental de ilíaca engrosamiento óseo en pacientes Litotricia a principios de 1980, se llevaron a cabo los primeros estudios para evaluar el efecto del tratamiento con ondas de choque (SWT) en el hueso de curación 1. Resultados impresionantes de una mejor curación de seudoartrosis de huesos largos se pudieron observar 2. Posteriormente, las indicaciones se ampliaron a las heridas de tejidos blandos 3. Resultados de las investigaciones básicas mostraron que las ondas de choque causan un estímulo biológico al tejido diana sin ningún daño posterior. La liberación de factores de crecimiento angiogénicos (por ejemplo, VEGF, PlGF, FGF) es seguida por una angiogénesis significativa. Esto condujo a una mayor expansión de las indicaciones hacia las patologías isquémicas. Nuestro grupo y otros mostraron el eff positivoect de SWT en la cardiopatía isquémica en modelos animales como en ensayos clínicos 4-6. Sin embargo, el mecanismo exacto de cómo se traduce el estímulo físico de SWT en una señal biológica (mecanotransducción) permanece en gran medida desconocido. A medida que el interés en la SWT de varios campos de la medicina aumenta continuamente, la búsqueda del mecanismo es cada vez más intensa. Por lo tanto, los experimentos in vitro de ondas de choque están ganando importancia. Además de la reducción de la experimentación con animales y la rentabilidad, la mayor ventaja de vitro tratamiento con ondas de choque en (IVSWT) puede ser la posibilidad de estudiar el comportamiento específico de un determinado tipo de célula. En onda de choque la regeneración de tejidos mediada más probable todas las células del tejido tratado están involucrados, se discuten incluso efectos sistémicos. Sin embargo, cada tipo de célula juega un papel específico y tiene su propia función intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta función en particular unnd con lo que nos da una mejor comprensión de los procesos subyacentes complejas. El conocimiento de hoy acerca de los efectos de las ondas de choque en cultivos de células incluye el aumento de la proliferación, la alteración de los receptores de la membrana celular, aumento y la aceleración de la diferenciación celular, la liberación de factores de crecimiento y quimioatrayentes, así como aumento de la migración celular 7-9. Se han descrito efectos físicos que causan distracción en la mayoría de modelos in vitro varios métodos de aplicación de ondas de choque en cultivos celulares. Este hecho conduce al problema de que es muy difícil comparar los resultados, ya que las condiciones físicas de la estimulación de células son muy diferentes entre estos modelos. En general, todos los modelos existentes se centran en cómo aplicar mejor las ondas de choque en las células. Sin embargo, esta pregunta sigue siendo: ¿Qué sucede con las olas después de pasar el cultivo celular? El problema principal es que la diferencia de la acústicaimpedancia del medio de cultivo celular y el aire ambiente es tan alto, que más del 99% de ondas de choque se reflejan la Figura 1. Debido a la diferencia en la impedancia acústica de los dos medios de las ondas se reflejan no sólo pero un desplazamiento de fase de 180 ° se produce resulta en fuertes fuerzas de tracción a las células Figura 2. La impedancia acústica se define como el producto de la densidad de un material y su velocidad del sonido Z = ρ x c. Para el agua de la impedancia acústica es ZWater = 1440000 Ns / m 3, para que el aire que está a sólo 420 Ns / m 3. La gran diferencia de estos dos valores da lugar a la reflexión y el cambio de fase de las ondas de choque. El cambio de fase se vuelve un impulso de presión positiva en una onda de tensión. Incluso si esta fuerza de tracción no es perjudicial para las células, que interfiere con la idea de imitar los efectos de ondas de choque in vivo in vitro. In vivo estosfuerzas de tracción casi no se producen debido a las grandes estructuras del cuerpo. Además, la parte de atrás corriendo olas incluso puede perturbar los entrantes. Esto puede causar interferencias. Se conocen dos tipos de interferencia. La interferencia constructiva significa que se agregan dos olas que resulta en el doble de amplitud Figura 3. La interferencia destructiva ocurre si las ondas se encuentran diametralmente opuestos. Se hace que la abolición de las ondas (Figura 3). Por lo tanto, IVSWT necesita un modelo que permite a las ondas de choque para propagar después de pasar el cultivo celular. Baño de agua IVSWT Consideraciones siguientes las preocupaciones antes mencionados nos llevan a diseñar un baño de agua para evitar los problemas descritos Figura 4. Básicamente, consiste en un recipiente de plexiglás construido con una membrana para conectar cada tipo de onda de choque aplicador. Para el acoplamiento entre esta membrana y la transmisión de ultrasonidos aplicador GEL tiene que ser utilizado. El baño de agua se llena con agua desgasificada para evitar la cavitación que se produciría si el gas se soluted dentro del agua. Un calentador en la parte inferior con un sensor de temperatura conectado a una unidad de control permite regular la temperatura para la imitación de las condiciones in vivo y para evitar cultivos de células se enfríe durante el procedimiento. Temperatura se puede mantener estable a 37 grados centígrados, como se hace en una incubadora. Un soporte para las muestras de células permite la inmersión de cualquier tipo de frasco de cultivo o tubo. De este modo, el recipiente de la muestra necesita ser completamente lleno con medio de cultivo, como burbujas de aire bloquearían ondas de choque! Un absorbedor en forma de cuña en la pared del fondo de la bañera destructs olas con el fin de no quedar reflejada y volver corriendo para evitar interferencias. Una ventaja adicional a otros modelos IVSWT es la posibilidad de variar la distancia entre el aplicador y los frascos de cultivo. Los hallazgos de nuestro grupo y otros que utilizan este modelo es claramentecómo que cada tipo de célula reacciona muy específicamente a diferentes parámetros de tratamiento. Por otra parte, la definición de la distancia entre la fuente de las ondas y la muestra es crucial, ya que nos permite controlar las células para estar en una posición específica en relación con el enfoque de la onda de choque aplicador.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2002">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Orthogold shock wave device</td>
			<td colspan="2" style="width:756px;">Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA &#8211; manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany</td>
			<td style="width:827px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">IVSWT Water Bath V2.0</td>
			<td style="width:537px;">Johann Hohenegger - Technical Products</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&#38;Growth Factors</td>
			<td style="width:537px;">Lonza</td>
			<td style="width:219px;">CC-3156 &#38; CC-4176</td>
			<td>This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"><a href="http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html">Pechiney&#160;Parafilm M PM996</a></td>
			<td style="width:537px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PH-LF-PM996-EA at labplanet.com</td>
			<td>for sealing flasks</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Falcon Serological pipets 25ml</td>
			<td style="width:537px;">Becton Dickinson Labware</td>
			<td style="width:219px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">CellMate II Serological Pipette&#160;</td>
			<td style="width:537px;">Matrix Technologies</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Skintact Ultrasonic Gel</td>
			<td style="width:537px;">Skintact</td>
			<td style="width:219px;">UL-01 250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">T25 cell culture flasks</td>
			<td style="width:537px;">COSTAR</td>
			<td style="width:219px;">3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">mikrozid disinfectant</td>
			<td style="width:537px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">3,5l degassed water</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">paper towels</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shock wave application to cell cultures

Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Resultados de las investigaciones básicas demostraron que las ondas de choque causan un estímulo biológico a las células o tejido diana sin ningún daño posterior. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Se han descrito varios métodos de aplicación de ondas de choque en cultivos celulares. En general, todos los modelos existentes se centran en cómo aplicar mejor las ondas de choque en las células. Sin embargo, esta pregunta sigue siendo: ¿Qué sucede con las olas después de pasar el cultivo celular? La diferencia de la impedancia acústica del medio de cultivo celular y el aire ambiente es tan alto, que más del 99% de ondas de choque se reflejan! Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo que consiste principalmente en un recipiente de plexiglás incorporado que permite a las olas se propaguen en el agua después de pasar el cultivo celular. Esto evita efectos de cavitación, así como la reflexión de las ondas que de otra manera perturbar los próximos. With este modelo somos capaces de imitar las condiciones in vivo y por lo tanto ganar más y más conocimiento sobre cómo el estímulo físico de las ondas de choque se traduce en una señal de célula biológica (&quot;mechanotransduction&quot;).

Usando el método descrito se aplicó ondas de choque a las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) que anteriormente aisladas de los cordones umbilicales. El cordón umbilical se obtuvieron de cesáreas electivas. HUVECs fueron tratados en una confluencia de 90% en un matraz de cultivo de células T25 con un sistema de tratamiento con ondas de choque electrohidráulica. Los parámetros de tratamiento eran una densidad de flujo de energía de 0,1 mJ / mm 2 y una fre...

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Shock Wave Application to Cell Cultures

Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo in vitro para los ensayos de la onda de choque en (IVSWT) que nos permite imitar las condiciones in vivo, evitando así los efectos físicos que distraen.

Shock Wave aplicación a los cultivos celulares

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

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12.6K vistas.  Innsbruck Medical University.  Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo in vitro para los ensayos de la onda de choque en (IVSWT) que nos permite imitar las condiciones in vivo, evitando así los efectos físicos que distraen. 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Ingeniería fibrina basado en construcciones de tejido de miofibroblastos y de aplicación de las restricciones y la tensión para inducir la organización de células y colágeno (Re)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Aumento de la durabilidad de cultivos de células neurales disociadas utilizando matriz coralina biológicamente activa

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...