המחברים מודים ריינר Schultheiss וולפגנג Schaden להשראה שלהם עבור דגם זה. אנו מודים גם Dorfmüller הנוצרי עבורו את כל המאמצים אדירים הזמן כדי לתמוך במחקר שלנו. תודה רבות לרוברט Göschl והנס Hohenegger למימוש טכני מדוקדק של הרעיונות שלנו!

אישור אתי לאחר קבלת כתב הסכמה מדעת של חולים, חבלי טבור התקבלו מניתוח קיסרי במחלקה לגינקולוגיה לבידוד של תאים אנושיים טבור אנדותל הווריד (HUVECs). הרשאה ניתנה מוועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית אינסברוק (מס &#39;UN4435). 1. הכן את אמבט IVSWT המים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3.5 L של מים ברז במכל מתאים. מים צריך להיות מחוממים ל37 מעלות צלזיוס (ראה פרוטוקול 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את המים לתוך אמבט המים עד למפלס המים הוא כ 3 ס&quot;מ מתחת לקצה. אכפת לי לכסות את הקרום במים לחלוטין. זה ידרוש כ 3.5 L. מוכן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את חיישן הטמפרטורה לאספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החיישן למדידה נועדה על הקיר האחורי של אמבט המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר חימום לאספקת חשמל של חיישן הטמפרטורה. אל תעשה את זה בלימים באמבט כדוד הייתי להמס את הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהמים מגיעים לטמפרטורה יציבה של 37 ° C. מערבבים את המים באופן קבוע עם איזה מקל כדי להבטיח טמפרטורה קבועה לאורך כל אמבט המים. </li></ol> 2. הכן את התאים וצלוחיות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על פני הלילה בצפיפות רצויה בתרבות צלוחיות T25 או תרבות התאים בצלוחיות ישירות עד שהם הגיעו לנקודת המפגש הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, ליישר את צלוחיות בצורה אנכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את צלוחיות התרבות עם התרבות בינונית עד ממש מתחת לצווארם. אל תמלאו יותר מדי בינוני לתוך צלוחיות כבינוניות בקשר לצוואר או כובע הסגירה היית מקבל מזוהמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג את צלוחיות עם כובעים מוצקים ללא מסננים על מנת למנוע זיהום ממים. אכפת שהמים באמבטיה והאמבטיה עצמה הן לא סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את כובעים עם Parafilm לפני הכניסה לתוך אמבט המים. </li> &lt;li&gt; תקן תרבות צלוחיות חתומות בדוכן שסופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בקבוק קבוע לתוך אמבט המים. תשמור על עצמך שאמצע בקבוק תרבית תאים הוא באותו הגובה כמרכז של הקרום של המוליך גל ההלם. בתור בצד של האמבטיה מנחה אותך. </li></ol> 3. הגדרת טיפול פרמטרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מרחק בין מקור גל ההלם ומדגם. זהה את הפרמטרים טיפול מושלמים על ידי ביצוע ניסוי פיילוט ממצא פרמטר כמתואר באיור 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרמטרים הנכונים לטיפול (צפיפות שטף אנרגיה, תדירות) על מכשיר גל הלם. שוב, עיין באיור 6. </li></ol> 4. Shock Wave יישום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמויות שפע של ג&#39;ל שידור אולטרסאונד זמין מסחרי במוליך גל ההלם, כמו גם על הממברנה של אמבט המים. הדבר נעשה כדי להבטיח צימוד. אין בועות אוויר או אוויר צריכה להיות בין המוליך והקרום כמוזה יהיה לקלוט גלי הלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר המוליך לממברנה ולהחזיק אותו יציב במרכז של הממברנה. תשמור על עצמך שיהיה מיושר אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמצב האנכי הנכון של החללית בתוך אמבט המים בקנה אחד עם סימון מצויינים בצד השני של האמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק מרכזים של המוליך ויציב הבקבוק בקו אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מכשיר גל הלם וליישם את הדחפים, תוך שמירה על בקבוק התרבות, כמו גם את המוליך במצב יציב במהלך ההליך כולו. </li></ol> 5. לאחר טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בקבוק התרבות מחוץ לאמבט המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש אותו במגבות נייר משותפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את הבקבוק בצורה מדויקת עם סוכני חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר איטום Parafilm וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בינונית בתוך צלוחיות לתוך צינורות הצנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כראוי. פרמטרים צנטריפוגה תלויים בסוג התא בשימוש, <em&gt; למשל. לHUVECs, השתמש 290 גרם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות תא לבקבוק. Resuspend התא גלולה centrifuged עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות תא. פיפטה ההשעיה לתוך הבקבוק. לפיכך, שברי תא או תאים שעלולים הופרדו במהלך טיפול לא הולכים לאיבוד. </li></ol> החסרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה, כמו גם טיפול צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בתוך הזרימה למינרית כדי למנוע זיהום של תרבית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפועל תרבית תאים טובות מומלץ כדי למנוע זיהום של הבדיקות. בפרט חיטוי של החלק החיצוני של צלוחיות מומלץ מאוד לפני שמכניס חזרה לחממה אותם. אמבט המים, כמו גם בתוך המים, לא סטרילי! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תחבר את התנור לאספקת החשמל, אלא אם כן אמבט מים מלא במים כדי למנוע נזק לפרספקס נבנה אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמויות נדיבות של ג&#39;ל אולטרסאונד על Appl גל ההלםicator להבטיח צימוד נכון והתפשטות גלים לאמבטיה. בועות אוויר אוויר ואפילו קטנים לעשות לספוג גלי הלם! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את העמדה של הבדיקות בתוך אמבט המים ביחס למוליך כדי להבטיח טיפול באזור הגידול כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל dunk בדיקות עמוקים מדי לתוך המים, כדי למנוע זיהום. </li></ol>

<ol>
	<li>Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shock+waves+on+fracture+healing.">Influence of shock waves on fracture healing.</a> Urology. 39, 529-532 (1992).</li><li>Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+of+nonunion+or+delayed+osseous+union.">Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).</li><li>Schaden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+therapy+for+acute+and+chronic+soft+tissue+wounds:+a+feasibility+study.">Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study.</a> J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).</li><li>Tepek&#246;yl&#252;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+treatment+induces+angiogenesis+and+mobilizes+endogenous+CD31/CD34-positive+endothelial+cells+in+a+hindlimb+ischemia+model:+Implications+for+angiogenesis+and+vasculogenesis.">Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).</li><li>Nishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+markedly+ameliorates+ischemia-induced+myocardial+dysfunction+in+pigs+in+vivo.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.</a> Circulation. 110, 3055-3061 (2004).</li><li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+ameliorates+myocardial+ischemia+in+patients+with+severe+coronary+artery+disease.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease.</a> Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).</li><li>Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-time+non-enzymatic+nitric+oxide+synthesis+from+L-arginine+and+hydrogen+peroxide+induced+by+shock+waves+treatment.">Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment.</a> FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).</li><li>Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+shock+wave+mediates+membrane+hyperpolarization+and+Ras+activation+for+osteogenesis+in+human+bone+marrow+stromal+cells.">Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).</li><li>Mittermayr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+(ESWT)+minimizes+ischemic+tissue+necrosis+irrespective+of+application+time+and+promotes+tissue+revascularization+by+stimulating+angiogenesis.">Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis.</a> Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).</li><li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis.">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

המשמעות של המודל המוצע לטיפול במבחנה גל הלם היא העובדה שגלים יכולים להפיץ לאחר שעברו את תרבית התאים בניגוד לדגמים קיימים. ובכך, ניתן להימנע מתופעות מטרידות פיזיות כגון כוחות מתיחים. המודל דומה יותר בתנאי vivo מזה על ידי אחרים יישום גלים לצלוחיות תרבית תאים של...

גלי הלם הם גלי לחץ קול הנובעים משחרור פתאומי של אנרגיה, למשל. כמו רעם כאשר ברקים. ברפואת גלי הלם היו בשימוש במשך 30 שנים בLithotripsy להתפוררות של אבנים בכליות. מאז הממצא הנלווה של עיבוי עצם הכסל בחולי Lithotripsy בתחילת 1980s, מחקרים ראשונים שנערכו על מנת להעריך את ההשפעה של טיפול גל הלם (SWT) על עצם ריפוי 1. תוצאות מרשימות של ריפוי משופר של nonunions ארוך עצם יכולה להיבחן 2. בהמשך לכך, הורחבו אינדיקציות לפצעים ברקמות רכים 3. ממצאי מחקר בסיסיים הראו שגלי הלם שגורמים לגירוי ביולוגי לרקמות היעד ללא כל נזק שלאחר מכן. שחרורו של גורמי גדילת angiogenic (למשל VEGF, PlGF, FGF) ואחריו אנגיוגנזה המשמעותית. זה הוביל להרחבה נוספת של אינדיקציות לכיוון פתולוגיות איסכמי. הקבוצה ואחרים שלנו הראו EFF החיוביect של SWT על מחלת לב איסכמית במודלים של בעלי חיים, כמו גם בניסויים קליניים 4-6. עם זאת, המנגנון של איך הגירוי הפיזי של SWT מתורגם לאותות ביולוגיים (mechanotransduction) המדויק נשאר במידה רבה לא ידוע. כעניין בSWT ממספר תחומים של רפואת עליות ברציפות, את החיפוש אחר המכניזם הוא מקבל יותר ויותר אינטנסיבי. לכן, בניסויים במבחנה גל הלם צוברים חשיבות. חוץ מצמצום ניסויים בבעלי החיים ועלות משתלמת, היתרון הגדול ביותר של במבחנה טיפול בהלם גל (IVSWT) עשוי להיות האפשרות ללמוד את ההתנהגות הספציפית של סוג תא מסוים. בהתחדשות רקמות בתיווך גל הלם סביר להניח שכל התאים של הרקמה שטופלה מעורבים, גם תופעות מערכתיות הם דנו. עם זאת, כל סוג תא ממלא תפקיד מסוים ויש לו תפקיד המהותי משלה. IVSWT מאפשר לנו לזהות פונקציה מסוימת זהnd ובכך נותן לנו הבנה טובה יותר של התהליכים הבסיסיים המורכבים. הידע של היום על ההשפעות של גל הלם בתרביות תאים כולל גידול של שגשוג, שינוי של קולטני קרום תא, עלייה והאצת התמיינות תאים, שחרור של גורמי גדילה והכימותרפיה משיכה, כמו גם נדידת תאים מוגברת 7-9. השפעות פיזיות מסיחות את הדעת ברוב במודלים חוץ גופית שיטות שונות של יישום גלי הלם על תרביות תאים כבר תיארו. עובדה זו מובילה לבעיה שקשה מאוד להשוות את התוצאות, כתנאים פיזיים של גירוי תאים שונים לגמרי בין דגמים אלה. באופן כללי, כל הדגמים הקיימים להתמקד איך ליישם הטוב ביותר גלי הלם על גבי תאים. עם זאת, שאלה זו נותרה פתוחה: מה קורה לגלים לאחר שעבר את תרבית התאים? הבעיה העיקרית היא שההבדל של אקוסטיתעכבה של מדיום תרבית תאים ואוויר הסביבה היא כל כך גבוהה, כי יותר מ 99% מגלי הלם מקבלים ביטוי איור 1. בשל ההבדל בהתנגדות האקוסטית של שתי מדיה הגלים משתקפים לא רק, אלא שלב משמרת של 180 ° מתרחשת כתוצאה מכך כוחות מתיחה חזקים לתאי איור 2. עכבה אקוסטית מוגדרת כתוצר של הצפיפות של חומר וZ מהירות קול שלה = ρ x ג. למים העכבה אקוסטית היא ZWater = 1,440,000 Ns / 3 מ &#39;, לאוויר זה רק 420 Ns / m 3. ההבדל הגדול בין שני ערכים אלה גורם לשינוי השתקפות ושלב של גלי הלם. פאזה הופכת דופק לחץ חיובי לגל מתיחה. גם אם כוח מתיחה זו אינו מזיק לתאים, והוא משבש את הרעיון של חיקוי בהשפעות גל הלם vivo במבחנה. בvivo אלהכוחות המתיחה כמעט ולא מתרחשים, בגלל מבנה גוף גדול. יתר על כן, בחלק האחורי פועל גלים יכול אפילו להפריע הנכנסים אלה. זה עלול לגרום להפרעות. שני סוגים של הפרעה ידועים. התאבכות בונה אומרת ששני הגלים נוספים ובכך וכתוצאה מכך הוכפל המשרעת איור 3. התערבות הרסנית מתרחשת אם גלים לפגוש מנוגדים. זה גורם לביטול של גלים (איור 3). לכן, IVSWT צריך מודל המאפשר לגלי הלם להפיץ לאחר שעבר את תרבית התאים. אמבט מים IVSWT שיקולים הבאים החששות שהוזכרו לעיל יובילו אותנו לעיצוב אמבט מים למניעת הבעיות שתוארו איור 4. בעיקרון, זה מורכב מפרספקס בנוי מיכל עם קרום להתחבר לכל סוג של המוליך גל הלם. לצימוד בין הקרום הזה והולכת אולטרסאונד המוליך gel יש להשתמש. אמבט המים מלא במי degassed להימנע cavitation שיתרחש אם הגז היה soluted בתוך המים. דוד בתחתית עם חיישן טמפרטורה המחובר ליחידת בקרה מאפשר לווסת את הטמפרטורה לחיקוי של in vivo תנאים ולהימנע מתרביות תאים להתקרר במהלך ההליך. טמפרטורה יכולה להיות מוחזקת יציבה ב37 מעלות צלזיוס כפי שזה נעשה בחממה. בעל לדגימות התאים מאפשר לטבילה כל סוג של בקבוק תרבות או צינור. ובכך, כלי המדגם צריך להיות מלא לחלוטין עם מדיום התרבות, כמו בועות אוויר יחסמו את גלי הלם! בולם בצורת טריז בקיר האחורי של האמבטיה destructs גלים על מנת שלא לקבל לידי ביטוי ולרוץ בחזרה, כדי למנוע הפרעה. יתרון נוסף לדגמי IVSWT אחרים הוא האפשרות של שינוי המרחק בין המוליך וצלוחיות התרבות. ממצאים של הקבוצה שלנו ואחרים שמשתמשים במודל זה באופן ברור זהאיך שכל סוג תא מגיב באופן ספציפי מאוד לפרמטרי טיפול שונים. יתר על כן, המגדיר את המרחק בין המקור של הגלים והמדגם הוא קריטי שכן הוא מאפשר לנו לשלוט על התאים להיות במיקום מסוים ביחס למוקד של המוליך גל הלם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2002">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Orthogold shock wave device</td>
			<td colspan="2" style="width:756px;">Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA &#8211; manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany</td>
			<td style="width:827px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">IVSWT Water Bath V2.0</td>
			<td style="width:537px;">Johann Hohenegger - Technical Products</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&#38;Growth Factors</td>
			<td style="width:537px;">Lonza</td>
			<td style="width:219px;">CC-3156 &#38; CC-4176</td>
			<td>This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"><a href="http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html">Pechiney&#160;Parafilm M PM996</a></td>
			<td style="width:537px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PH-LF-PM996-EA at labplanet.com</td>
			<td>for sealing flasks</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Falcon Serological pipets 25ml</td>
			<td style="width:537px;">Becton Dickinson Labware</td>
			<td style="width:219px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">CellMate II Serological Pipette&#160;</td>
			<td style="width:537px;">Matrix Technologies</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Skintact Ultrasonic Gel</td>
			<td style="width:537px;">Skintact</td>
			<td style="width:219px;">UL-01 250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">T25 cell culture flasks</td>
			<td style="width:537px;">COSTAR</td>
			<td style="width:219px;">3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">mikrozid disinfectant</td>
			<td style="width:537px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">3,5l degassed water</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">paper towels</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shock wave application to cell cultures

גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. ממצאי מחקר בסיסיים הראו שגלי הלם שגורמים לגירוי ביולוגי למקד תאים או רקמות ללא כל נזק שלאחר מכן. לכן, בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. שיטות שונות של יישום גלי הלם על תרביות תאים כבר תיארו. באופן כללי, כל הדגמים הקיימים להתמקד איך ליישם הטוב ביותר גלי הלם על גבי תאים. עם זאת, שאלה זו נותרה פתוחה: מה קורה לגלים לאחר שעבר את תרבית התאים? ההבדל של העכבה אקוסטית של מדיום תרבית התאים ואוויר הסביבה הוא כל כך גבוה, כי יותר מ 99% מגלי הלם מקבלים לידי ביטוי! לפיכך, אנו פיתחנו מודל המורכב בעיקר מיכל פרספקס בנוי המאפשר הגלים כדי להפיץ במים לאחר שעברו את תרבית התאים. זה ימנע תופעות cavitation, כמו גם השתקפות של הגלים שאחרת להפריע הקרובים אלה. Wiה מודל זה אנו מסוגלים לחקות in vivo תנאים וכך לקבל עוד ועוד ידע על איך הגירוי הפיזי של גלי הלם מקבל מתורגם לאותות ביולוגיים תא (&quot;mechanotransduction&quot;).

שימוש בשיטה המתוארת אנחנו מוחלים גלי הלם לתאי אנדותל וריד טבור אנושיים (HUVECs) שצוינו מבודדת מחבלי טבור. חבלי טבור התקבלו מסעיפים קיסריים אלקטיבי. טופלו HUVECs במפגש של 90% בבקבוק תרבית תאי T25 עם מערכת טיפול גל הלם אלקטרו. פרמטרים טיפול ?...

Watch this Scientific Journal Video about Shock Wave Application to Cell Cultures at JoVE.com

Shock Wave Application to Cell Cultures

גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. לכן בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. לפיכך, אנו פיתחנו מודל לניסויים במבחנה הלם גל (IVSWT) המאפשר לנו לחקות בתנאי vivo ובכך להימנע השפעות פיזיות מסיחות את הדעת.

Shock Wave אפליקציות לסלולריים תרבויות

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Bioengineering

Unit 1

Waves

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K Views.  Innsbruck Medical University.  גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. לכן בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. לפיכך, אנו פיתחנו מודל לניסויים במבחנה הלם גל (IVSWT) המאפשר לנו לחקות בתנאי vivo ובכך להימנע השפעות פיזיות מסיחות את הדעת. 

Video: Shock Wave Application to Cell Cultures

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...