Gli autori ringraziano Reiner Schultheiss e Wolfgang Schaden per la loro ispirazione per questo modello. Ringraziamo anche Christian Dorfmüller per i suoi tutti gli enormi sforzi di tempo per sostenere la nostra ricerca. Molte grazie a Robert Göschl e Hans Hohenegger per un&#39;attenta realizzazione tecnica delle nostre idee!

Autorizzazione etica Dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dei pazienti, cordoni ombelicali sono stati ottenuti da taglio cesareo presso il Dipartimento di Ginecologia per l&#39;isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC). Il permesso è stato dato dal comitato etico di Innsbruck Medical University (n. UN4435). 1. Preparare il bagno di acqua IVSWT <ol><li> Preparare 3,5 L di acqua di rubinetto in un apposito serbatoio. Acqua deve essere riscaldata a 37 ° C (vedi protocollo 6). </li><li> Riempire l&#39;acqua nel bagnomaria finché il livello dell&#39;acqua è di circa 3 cm sotto il bordo. Mente a coprire completamente la membrana con acqua. Ciò richiederà circa il preparato 3,5 L. </li><li> Collegare il sensore di temperatura per l&#39;alimentazione. </li><li> Inserire la sonda nel raccordo prevista sulla parete posteriore della vasca dell&#39;acqua. </li><li> Collegare riscaldamento all&#39;alimentazione del sensore di temperatura. Non fare questo senzal&#39;acqua nella vasca da bagno come il riscaldamento sarebbe sciogliere il plexiglas. </li><li> Attendere che l&#39;acqua ha raggiunto una temperatura stabile di 37 ° C. Mescolare l&#39;acqua regolarmente con qualche tipo di bastone da garantire temperatura costante in tutto il bagnomaria. </li></ol> 2. Preparare Celle e Palloni Cultura <ol><li> Celle di semi per tutta la notte a densità desiderata in fiasche di coltura T25 o cultura le cellule nei palloni direttamente fino a quando non hanno raggiunto la confluenza desiderata. </li><li> Prima dell&#39;esperimento, allineare i palloni in verticale. </li><li> Riempire i flaconi di coltura con terreno di coltura fino a quando proprio sotto il collo. Non riempire troppo medie nelle fiasche da medio a contatto al collo o il tappo di chiusura otterrebbe contaminati. </li><li> Avvitare i flaconi con i tappi solidi senza filtri per prevenire la contaminazione da acqua. Presente che l&#39;acqua nella vasca e bagno stesso non sono sterili. </li><li> Sigillare i tappi con parafilm prima dell&#39;inserimento nella vasca d&#39;acqua. </li> &lt;li&gt; Fix cultura palloni chiusi nel supporto fornito. </li><li> Inserire il pallone fisso in bagno d&#39;acqua. Assicurarsi che la metà del pallone di coltura cellulare è alla stessa altezza del centro della membrana dell&#39;onda dell&#39;applicatore shock. Una linea a lato della vasca guida. </li></ol> 3. Definire parametri di trattamento <ol><li> Definire la distanza tra la sorgente onde d&#39;urto e campione. Identificare i parametri di trattamento perfetti conducendo l&#39;esperimento pilota parametro constatazione come descritto nella Figura 6. </li><li> Scegli i parametri di trattamento giusti (densità del flusso di energia, frequenza) sul dispositivo onde d&#39;urto. Anche in questo caso, fare riferimento alla Figura 6. </li></ol> 4. Shock Wave Application <ol><li> Mettere quantità molto gel trasmissione ultrasuoni disponibile in commercio sull&#39;onda applicatore urti e sulla membrana del bagnomaria. Questo per assicurare l&#39;accoppiamento. Bolle d&#39;aria o aria devono essere tra l&#39;applicatore e la membrana comesarebbe assorbire onde d&#39;urto. </li><li> Collegare applicatore alla membrana e tenerlo stabile nel centro della membrana. Fate attenzione che sia allineato orizzontalmente. </li><li> Assicurarsi che la posizione verticale corretta della sonda all&#39;interno del bagno d&#39;acqua è in linea con l&#39;indicato contrassegno sul bordo della vasca. </li><li> Tenere centri dell&#39;applicatore e stabile matraccio in una linea orizzontale. </li><li> Attivare il dispositivo ad onde d&#39;urto e applicare gli impulsi mantenendo il pallone di coltura e l&#39;applicatore in posizione stabile durante l&#39;intera procedura. </li></ol> 5. Dopo trattamento <ol><li> Prendete il pallone di coltura fuori bagnomaria. </li><li> Asciugare con carta assorbente comuni. </li><li> Pulire il pallone con precisione con agenti disinfettanti. </li><li> Rimuovere tenuta Parafilm e cappuccio. </li><li> Pipettare il Piano all&#39;interno dei palloni in tubi centrifughi. </li><li> Centrifugare adeguatamente. Parametri di centrifugazione dipendono dal tipo cellulare utilizzato, <em&gt; Ad es. per HUVEC, utilizzare 290 g a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 ml di terreno di coltura cellulare al pallone. Risospendere il pellet di cellule centrifugato con 2 ml di mezzo di coltura cellulare. Pipettare la sospensione nella beuta. Così, frammenti cellulari o cellule che possono essere stati staccati durante il trattamento non si perdono. </li></ol> Insidie <ol><li> Preparazione e trattamento devono essere eseguite in condizioni sterili all&#39;interno flusso laminare per evitare la contaminazione della coltura cellulare. </li><li> Buone pratiche di coltura cellulare si raccomanda di evitare la contaminazione delle sonde. In particolare, la disinfezione della parte esterna dei flaconi è fortemente consigliata prima di rimetterli al incubatrice. Il bagno d&#39;acqua, così come l&#39;interno dell&#39;acqua, non è sterile! </li><li> Non collegare il riscaldatore alla rete elettrica a meno che il bagno di acqua viene riempito con acqua per evitare danni ai plexiglas costruiti bagno. </li><li> Utilizzare una generosa quantità di gel per ultrasuoni sulla appl onda d&#39;urtoicator per garantire il corretto accoppiamento e la propagazione delle onde nel bagno. Aria e anche piccole bolle d&#39;aria fanno assorbire le onde d&#39;urto! </li><li> Controllare la posizione delle sonde all&#39;interno del bagno d&#39;acqua in relazione alla applicatore per assicurare il trattamento di tutta l&#39;area di crescita. </li><li> Non dunk sonde troppo in profondità in acqua per evitare la contaminazione. </li></ol>

<ol>
	<li>Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shock+waves+on+fracture+healing.">Influence of shock waves on fracture healing.</a> Urology. 39, 529-532 (1992).</li><li>Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+of+nonunion+or+delayed+osseous+union.">Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).</li><li>Schaden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+therapy+for+acute+and+chronic+soft+tissue+wounds:+a+feasibility+study.">Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study.</a> J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).</li><li>Tepek&#246;yl&#252;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+treatment+induces+angiogenesis+and+mobilizes+endogenous+CD31/CD34-positive+endothelial+cells+in+a+hindlimb+ischemia+model:+Implications+for+angiogenesis+and+vasculogenesis.">Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).</li><li>Nishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+markedly+ameliorates+ischemia-induced+myocardial+dysfunction+in+pigs+in+vivo.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.</a> Circulation. 110, 3055-3061 (2004).</li><li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+ameliorates+myocardial+ischemia+in+patients+with+severe+coronary+artery+disease.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease.</a> Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).</li><li>Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-time+non-enzymatic+nitric+oxide+synthesis+from+L-arginine+and+hydrogen+peroxide+induced+by+shock+waves+treatment.">Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment.</a> FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).</li><li>Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+shock+wave+mediates+membrane+hyperpolarization+and+Ras+activation+for+osteogenesis+in+human+bone+marrow+stromal+cells.">Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).</li><li>Mittermayr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+(ESWT)+minimizes+ischemic+tissue+necrosis+irrespective+of+application+time+and+promotes+tissue+revascularization+by+stimulating+angiogenesis.">Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis.</a> Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).</li><li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis.">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il significato del modello proposto per trattamento con onde d&#39;urto vitro in è il fatto che le onde possono propagarsi dopo aver superato la coltura cellulare in contrasto con i modelli esistenti. In tal modo, effetti fisici disturbanti come forze di trazione possono essere evitati. Il modello assomiglia più da vicino le condizioni in vivo di quella da altri applicando onde per loro fiasche di coltura cellulare direttamente. Un ulteriore vantaggio è la possibilità d...

Le onde d&#39;urto sono onde di pressione sonora derivanti da un improvviso rilascio di energia, ad es. come un tuono quando un fulmine. In medicina sono state utilizzate onde d&#39;urto per oltre 30 anni nel litotripsia per la disintegrazione dei calcoli renali. Dal momento che l&#39;accertamento incidentale della iliaca ispessimento dell&#39;osso in pazienti Litotrissia nei primi anni 1980, sono stati condotti i primi studi per valutare l&#39;effetto del trattamento ad onde d&#39;urto (SWT) sulla guarigione ossea 1. Risultati impressionanti di una migliore guarigione delle pseudoartrosi delle ossa lunghe possono essere osservate 2. Successivamente, le indicazioni sono stati ampliati per le ferite dei tessuti molli 3. Risultati di base ricerca ha mostrato che le onde d&#39;urto causano uno stimolo biologico al tessuto bersaglio senza alcun danno successiva. Rilascio di fattori di crescita angiogenici (ad esempio VEGF, PlGF, FGF) è seguita da una significativa angiogenesi. Ciò ha portato ad una ulteriore espansione delle indicazioni verso patologie ischemiche. Il nostro gruppo e altri hanno mostrato l&#39;eff positivoect di SWT sulla cardiopatia ischemica in modelli animali e in studi clinici 4-6. Tuttavia, il meccanismo esatto di come stimolo fisico del SWT si traduce in un segnale biologico (mechanotransduction) rimane in gran parte sconosciuta. Come l&#39;interesse in SWT da diversi campi della medicina aumenta continuamente, la ricerca del meccanismo sta diventando sempre più intenso. Pertanto, gli esperimenti in vitro onda d&#39;urto in stanno guadagnando importanza. Oltre alla riduzione degli esperimenti sugli animali e di costo-efficacia, il più grande vantaggio di vitro trattamento con onde d&#39;urto in (IVSWT) potrebbe essere la possibilità di studiare il comportamento specifico di un certo tipo di cellula. In onda d&#39;urto rigenerazione tissutale mediato probabilmente tutte le cellule del tessuto trattato sono coinvolti, anche effetti sistemici sono discussi. Tuttavia, ogni tipo di cellula svolge un ruolo specifico e ha una sua funzione intrinseca. IVSWT ci permette di rilevare questo particolare funzione di unnd così ci dà una migliore comprensione dei processi sottostanti complessi. La conoscenza di oggi sugli effetti scossa di onda su colture cellulari include l&#39;aumento della proliferazione, alterazione dei recettori di membrana delle cellule, aumento e l&#39;accelerazione della differenziazione cellulare, il rilascio di fattori di crescita e chemio-attrattivi così come una maggiore migrazione cellulare 7-9. Effetti fisici distrazione in più in modelli in vitro vari metodi di applicazione di onde d&#39;urto in colture cellulari sono state descritte. Questo fatto porta al problema che è molto difficile confrontare i risultati, come condizioni fisiche di stimolazione cellulare sono molto diverse tra questi modelli. In generale, tutti i modelli esistenti si concentrano su come applicare meglio le onde d&#39;urto sulle cellule. Tuttavia, questa domanda rimane: cosa succede alle onde dopo aver superato la coltura cellulare? Il problema principale è che la differenza di acusticaimpedenza del mezzo di coltura cellulare e l&#39;aria ambiente è quello alto, che oltre il 99% delle onde d&#39;urto vengono riflessi Figura 1. A causa della differenza di impedenza acustica dei due mezzi onde si riflettono non solo, ma un sfasamento di 180 ° si verifica conseguente forti forze di trazione alle cellule Figura 2. Impedenza acustica è definito come il prodotto della densità di un materiale e la sua velocità del suono Z = ρ x c. Per l&#39;acqua l&#39;impedenza acustica è ZWater = 1.440.000 Ns / m 3, per l&#39;aria è a soli 420 Ns / m 3. La grande differenza tra questi due valori si traduce in riflessione e sfasamento delle onde d&#39;urto. Lo sfasamento trasforma un impulso di pressione positiva in un&#39;onda di trazione. Anche se questa forza di trazione non è dannoso per le cellule, che interferisce con l&#39;idea di imitare in effetti dell&#39;onda d&#39;urto vivo in vitro. In vivo questiforze di trazione difficilmente si verificano a causa di strutture corporee di grandi dimensioni. Inoltre, la parte posteriore in esecuzione onde possono anche disturbare quelli in arrivo. Ciò può causare interferenze. Sono noti due tipi di interferenze. Interferenza costruttiva significa che entrambe le onde sono aggiunti un conseguente ampiezza raddoppiata Figura 3. Interferenza distruttiva si verifica se le onde si incontrano diametralmente opposto. Essa provoca abolizione delle onde (Figura 3). Pertanto, IVSWT bisogno di un modello che permette onde d&#39;urto per propagare dopo aver superato la coltura cellulare. IVSWT bagnomaria Considerazioni seguenti preoccupazioni sopra citati inducono a progettare un bagno d&#39;acqua per evitare i problemi descritti Figura 4. Fondamentalmente, si compone di un plexiglas costruita contenitore con una membrana per collegare ogni tipo di applicatore onda d&#39;urto. Per accoppiamento tra questa membrana e la trasmissione applicatore ultrasuoni gel deve essere utilizzato. Il bagno di acqua è piena di acqua degasata per evitare cavitazione che si verificherebbe se il gas è stato soluted all&#39;interno dell&#39;acqua. Un riscaldatore sul fondo con un sensore di temperatura collegato ad una unità di controllo permette di regolare la temperatura per imitazione di condizioni in vivo ed evitare colture cellulari per raffreddare durante la procedura. La temperatura può essere ritenuta stabile a 37 gradi centigradi come avviene in un incubatore. Un supporto per i campioni di cellule permette immergendo qualsiasi tipo di pallone di coltura o del tubo. In tal modo, il contenitore del campione deve essere completamente riempito con terreno di coltura, come bolle d&#39;aria potrebbero bloccare le onde d&#39;urto! Un assorbitore cuneiforme alla parete posteriore della vasca distrugge onde per non vengono riflessi e correte per evitare interferenze. Un ulteriore vantaggio di altri modelli IVSWT è la possibilità di variare la distanza tra l&#39;applicatore e le fiasche di coltura. Giudizio del nostro gruppo e altri che utilizzano questo modello s chiaramentecome che ogni tipo di cellula reagisce specificamente a diversi parametri di trattamento. Inoltre, definendo la distanza tra la fonte delle onde e il campione è fondamentale in quanto ci permette di gestire le cellule per essere in una posizione specifica in relazione alla messa a fuoco dell&#39;applicatore onda d&#39;urto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2002">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Orthogold shock wave device</td>
			<td colspan="2" style="width:756px;">Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA &#8211; manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany</td>
			<td style="width:827px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">IVSWT Water Bath V2.0</td>
			<td style="width:537px;">Johann Hohenegger - Technical Products</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&#38;Growth Factors</td>
			<td style="width:537px;">Lonza</td>
			<td style="width:219px;">CC-3156 &#38; CC-4176</td>
			<td>This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"><a href="http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html">Pechiney&#160;Parafilm M PM996</a></td>
			<td style="width:537px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PH-LF-PM996-EA at labplanet.com</td>
			<td>for sealing flasks</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Falcon Serological pipets 25ml</td>
			<td style="width:537px;">Becton Dickinson Labware</td>
			<td style="width:219px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">CellMate II Serological Pipette&#160;</td>
			<td style="width:537px;">Matrix Technologies</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Skintact Ultrasonic Gel</td>
			<td style="width:537px;">Skintact</td>
			<td style="width:219px;">UL-01 250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">T25 cell culture flasks</td>
			<td style="width:537px;">COSTAR</td>
			<td style="width:219px;">3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">mikrozid disinfectant</td>
			<td style="width:537px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">3,5l degassed water</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">paper towels</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shock wave application to cell cultures

Le onde d&#39;urto al giorno d&#39;oggi sono ben noti per i loro effetti rigenerativi. I risultati di ricerca di base hanno dimostrato che le onde d&#39;urto causano uno stimolo biologico per colpire le cellule o tessuti senza alcun danno ulteriore. Pertanto, esperimenti in vitro sono di crescente interesse. Sono stati descritti vari metodi di applicazione di onde d&#39;urto in colture cellulari. In generale, tutti i modelli esistenti si concentrano su come applicare meglio le onde d&#39;urto sulle cellule. Tuttavia, questa domanda rimane: cosa succede alle onde dopo aver superato la coltura cellulare? La differenza di impedenza acustica del mezzo di coltura cellulare e l&#39;aria ambiente è quello alto, che oltre il 99% delle onde d&#39;urto vengono riflessi! Abbiamo quindi sviluppato un modello che consiste principalmente di un contenitore in plexiglas incorporato che permette alle onde di propagarsi in acqua dopo aver superato la coltura cellulare. Questo evita effetti di cavitazione e la riflessione delle onde che altrimenti disturbare quelli diffusioni. With questo modello siamo in grado di mimare le condizioni in vivo e quindi guadagnare di più e più conoscenze su come lo stimolo fisica delle onde d&#39;urto si traduce in un segnale cellula biologica (&quot;meccanotrasduzione&quot;).

Utilizzando il metodo descritto abbiamo applicato onde d&#39;urto per le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) che abbiamo afore isolato da cordoni ombelicali. Cordoni ombelicali sono state ottenute da tagli cesarei elettivi. HUVEC sono stati trattati con una confluenza del 90% in un pallone di coltura cellulare T25 con un sistema di onde d&#39;urto elettroidraulico. Parametri di trattamento erano una densità di flusso di energia di 0,1 mJ / mm 2 e una frequenza...

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Shock Wave Application to Cell Cultures

Le onde d&#39;urto al giorno d&#39;oggi sono ben noti per i loro effetti rigenerativi. Pertanto esperimenti in vitro sono di crescente interesse. Abbiamo quindi sviluppato un modello in vitro per le prove d&#39;urto in (IVSWT) che ci permette di simulare le condizioni in vivo evitando così effetti fisici distrazione.

Shock Wave Application to Cell Culture

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

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12.6K Views.  Innsbruck Medical University.  Le onde d'urto al giorno d'oggi sono ben noti per i loro effetti rigenerativi. Pertanto esperimenti in vitro sono di crescente interesse. Abbiamo quindi sviluppato un modello in vitro per le prove d'urto in (IVSWT) che ci permette di simulare le condizioni in vivo evitando così effetti fisici distrazione. 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ricerca

Bioingegneria

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Aumentare la durabilità delle colture di cellule neurali dissociate utilizzando la matrice corallina biologicamente attiva

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...