Os autores agradecem Reiner Schultheiss e Wolfgang Schaden por sua inspiração para este modelo. Agradecemos também Christian Dorfmüller para seus todos os esforços tremendos momento de apoiar a nossa pesquisa. Muito obrigado a Robert Göschl e Hans Hohenegger para realização técnica cuidadoso das nossas ideias!

Permissão de Ética Após a obtenção do consentimento livre e esclarecido dos pacientes, cordões umbilicais foram obtidos a partir de cesariana no Departamento de Ginecologia para o isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). A permissão foi dada a partir do comitê de ética da Universidade de Medicina de Innsbruck (no. UN4435). 1. Prepare o IVSWT Água Bath <ol><li> Prepare 3,5 L de água da torneira em um tanque apropriado. A água deve ser aquecida a 37 ° C (ver o Protocolo 6). </li><li> Encher a água para o banho de água até que o nível da água é de aproximadamente 3 cm abaixo da borda. Mente para cobrir completamente a membrana com água. Isto vai exigir a aproximadamente 3,5 L. preparado </li><li> Ligue o sensor de temperatura para a fonte de alimentação. </li><li> Colocar o sensor dentro da instalação destinada à parede traseira da água do banho. </li><li> Ligue o aquecimento a fonte de alimentação do sensor de temperatura. Não faça isso semágua no banho como o aquecedor poderia fundir o Plexiglas. </li><li> Espere até que a água tenha atingido uma temperatura estável de 37 ° C. Agita-se a água regularmente com algum tipo de vara para garantir uma temperatura constante em todo o banho de água. </li></ol> 2. Prepare Células e frascos de cultura <ol><li> Células de sementes durante a noite com densidade desejada em frascos de cultura T25 ou cultura as células em frascos diretamente até que tenham atingido a confluência desejada. </li><li> Antes do experimento, alinhe os frascos na vertical. </li><li> Encha os frascos de cultura com meio de cultura até logo abaixo do pescoço. Não encha demais médio em balões como meio de contato para o pescoço ou a tampa de fechamento iria ficar contaminada. </li><li> Aperte os frascos com capacitores sólidos sem filtros para evitar a contaminação da água. Mente que a água no banho e o banho em si não são estéreis. </li><li> Selar as tampas com Parafilm antes da inserção no banho-maria. </li> &lt;li&gt; Fix frascos de cultura fechados no suporte fornecido. </li><li> Insira frasco fixo na água do banho. Ter cuidado para que o meio do frasco de cultura de células é na mesma altura que o centro da membrana da onda de choque do aplicador. A fila do lado da banheira o orienta. </li></ol> 3. Definir Tratamento Parâmetros <ol><li> Defina a distância entre a fonte de ondas de choque e amostra. Identificar os parâmetros de tratamento perfeitos através da realização da experiência piloto parâmetro achado como descrito na Figura 6. </li><li> Escolha os parâmetros de tratamento de certas (densidade de fluxo de energia, frequência) no dispositivo de onda de choque. Mais uma vez, consulte a Figura 6. </li></ol> 4. Choque aplicação de ondas <ol><li> Coloque quantidades abundância de gel disponível no mercado de transmissão de ultra-som sobre a onda de choque do aplicador, bem como sobre a membrana do banho-maria. Isto é para assegurar o acoplamento. Não há bolhas de ar ou de ar deve estar entre o aplicador e a membrana quantoseria absorver as ondas de choque. </li><li> Ligue aplicador para a membrana e segurá-lo estável no centro da membrana. Tome cuidado para que ela esteja alinhada horizontalmente. </li><li> Certifique-se de que a posição vertical correcta da sonda no interior do banho de água é, de acordo com o indicado na marcação do lado da casa de banho. </li><li> Segurar centros do aplicador e o balão estável numa linha horizontal. </li><li> Activar o aparelho de ondas de choque e aplicar os impulsos, mantendo o frasco de cultura, bem como o aplicador numa posição estável durante todo o procedimento. </li></ol> 5. Depois do Tratamento <ol><li> Pegue a garrafa de cultura do banho de água. </li><li> Seque-o com toalhas de papel comuns. </li><li> Limpe o frasco de forma precisa com os agentes de desinfecção. </li><li> Remover Parafilm vedação e tampa. </li><li> Pipetar a média dentro dos frascos em tubos centrífugos. </li><li> Centrifugar adequadamente. Parâmetros centrifugação dependerá do tipo de célula utilizada, <em&gt; Por ex. para HUVECs, utilizar 290 g à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura de células para o balão. Ressuspender o sedimento de células centrifugadas com 2 ml de meio de cultura celular. Pipetar a suspensão para dentro do frasco. Assim, fragmentos de células ou células que podem ter sido isoladas durante o tratamento não se percam. </li></ol> Armadilhas <ol><li> Preparação, bem como o tratamento deve ser realizado sob condições estéreis para dentro de fluxo laminar, para evitar a contaminação da cultura de células. </li><li> Boas práticas de cultura de células é recomendada para evitar a contaminação das sondas. Em particular, a desinfecção da parte exterior dos frascos é fortemente recomendado antes de colocá-los para trás para a incubadora. O banho de água, bem como o interior da água, não é estéril! </li><li> Não ligar o aquecedor para o fornecimento de energia a não ser que o banho de água é enchido com água a fim de evitar danos para as Plexiglas construídos banho. </li><li> Use uma quantidade generosa de gel de ultra-som no appl onda de choqueicator para garantir acoplamento adequado e de propagação da onda no banho. Ar e até mesmo pequenas bolhas de ar absorvem as ondas de choque! </li><li> Verificar a posição das sondas no interior do banho de água em relação ao aplicador de garantir um tratamento de toda a área de crescimento. </li><li> Não mergulhe sondas muito profundo dentro da água para evitar a contaminação. </li></ol>

<ol>
	<li>Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shock+waves+on+fracture+healing.">Influence of shock waves on fracture healing.</a> Urology. 39, 529-532 (1992).</li><li>Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+of+nonunion+or+delayed+osseous+union.">Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).</li><li>Schaden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+therapy+for+acute+and+chronic+soft+tissue+wounds:+a+feasibility+study.">Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study.</a> J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).</li><li>Tepek&#246;yl&#252;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+wave+treatment+induces+angiogenesis+and+mobilizes+endogenous+CD31/CD34-positive+endothelial+cells+in+a+hindlimb+ischemia+model:+Implications+for+angiogenesis+and+vasculogenesis.">Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).</li><li>Nishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+markedly+ameliorates+ischemia-induced+myocardial+dysfunction+in+pigs+in+vivo.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.</a> Circulation. 110, 3055-3061 (2004).</li><li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+ameliorates+myocardial+ischemia+in+patients+with+severe+coronary+artery+disease.">Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease.</a> Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).</li><li>Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-time+non-enzymatic+nitric+oxide+synthesis+from+L-arginine+and+hydrogen+peroxide+induced+by+shock+waves+treatment.">Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment.</a> FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).</li><li>Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+shock+wave+mediates+membrane+hyperpolarization+and+Ras+activation+for+osteogenesis+in+human+bone+marrow+stromal+cells.">Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).</li><li>Mittermayr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+shock+wave+therapy+(ESWT)+minimizes+ischemic+tissue+necrosis+irrespective+of+application+time+and+promotes+tissue+revascularization+by+stimulating+angiogenesis.">Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis.</a> Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).</li><li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis.">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A significância do modelo proposto para tratamento in vitro da onda de choque é o facto de que as ondas possam propagar depois de passar a cultura de células em contraste com os modelos actuais. Desse modo, os efeitos físicos perturbadoras tais como as forças de tracção pode ser evitada. O modelo se assemelha mais de perto as condições in vivo do que por outros aplicando ondas para os seus frascos de cultura de célula diretamente. Uma vantagem adicional é a possi...

As ondas de choque são ondas de pressão sonora decorrentes de uma liberação repentina de energia, por exemplo. como o trovão quando um raio. Na medicina ondas de choque têm sido utilizados por mais de 30 anos de Litotripsia para a desintegração de pedras nos rins. Uma vez que o achado incidental de ilíaca espessamento óssea em pacientes Litotripsia no início de 1980, os primeiros estudos foram realizados para avaliar o efeito do tratamento por ondas de choque (SWT) no osso cura 1. Resultados impressionantes de melhoria da cura de pseudartroses de ossos longos pode ser observada 2. Subsequentemente, as indicações foram expandidos para feridas de tecidos moles 3. Resultados básicos de pesquisa mostrou que as ondas de choque que causam um estímulo biológico para o tecido-alvo, sem qualquer dano subsequente. A libertação de factores de crescimento angiogénicos (por exemplo, VEGF, PlGF, FGF) é seguido por angiogénese significativa. Isto levou a uma maior expansão de indicações para patologias isquêmicos. Nosso grupo e outros mostraram o eff positivoect de SWT na doença isquêmica do coração em modelos animais, bem como em ensaios clínicos 4-6. No entanto, o mecanismo exato de como o estímulo físico do SWT é traduzido em um sinal biológico (mechanotransduction) permanece em grande parte desconhecido. Como o interesse em SWT a partir de vários campos da medicina aumenta continuamente, a busca para o mecanismo está ficando mais e mais intensa. Portanto, experimentos in vitro onda de choque estão ganhando importância. Além da redução de experimentos com animais e relação custo-eficácia, a maior vantagem do tratamento in vitro por ondas de choque (IVSWT) pode ser a possibilidade de estudar o comportamento específico de um determinado tipo de célula. Em ondas de choque regeneração de tecidos mediada provavelmente todas as células do tecido tratado está envolvida, mesmo os efeitos sistémicos são discutidos. No entanto, cada tipo de célula tem um papel específico e tem a sua própria função intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta função especial, umand assim nos dá uma melhor compreensão dos processos subjacentes complexas. Conhecimentos actuais sobre os efeitos da onda de choque em culturas de células inclui o aumento da proliferação, transformação de receptores da membrana celular, aumento e aceleração da diferenciação das células, a libertação de factores de crescimento e quimio-atractivos, bem como o aumento da migração de células de 7-9. Efeitos físicos de distracção em mais em modelos in vitro de vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Este facto leva ao problema de que é muito difícil de comparar os resultados, como as condições físicas da estimulação de células são muito diferentes entre estes modelos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células. No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? O principal problema é que a diferença de o acústicoimpedância do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se Figura 1 reflectida. Devido à diferença de impedância acústica dos dois meios as ondas são reflectidas mas não só um deslocamento de fase de 180 ° ocorre resultando em fortes forças de tracção para as células a Figura 2. Impedância acústica é definido como o produto da densidade de um material e a sua velocidade do som Z = ρ x c. Para a água a impedância acústica é ZWater = 1440000 Ns / m 3, para o ar é apenas 420 Ns / m 3. A grande diferença desses dois valores resulta em reflexão e mudança de fase de ondas de choque. O deslocamento de fase transforma um impulso de pressão positiva para uma onda de tracção. Mesmo que essa força de tração não é prejudicial para as células, que interfere com a idéia de imitar em efeitos in vivo de ondas de choque, in vitro. In vivo estesas forças de tracção dificilmente ocorrem devido a grandes estruturas do corpo. Além disso, a parte de trás correndo ondas pode até incomodar os que chegam. Isso pode causar interferência. Dois tipos de interferência são conhecidos. Interferência construtiva significa que ambas as ondas são adicionadas, assim, resultando em dobro amplitude Figura 3. Interferência destrutiva ocorre se ondas se encontram diametralmente opostas. Ela provoca abolição de ondas (Figura 3). Portanto, IVSWT precisa de um modelo que permite que as ondas de choque que se propagam após a passagem da cultura de células. Banho de água IVSWT Considerações seguintes as preocupações mencionadas acima nos levam a projetar um banho de água para evitar os problemas descritos Figura 4. Basicamente, ele consiste em um recipiente de acrílico construído com uma membrana para conectar todo tipo de aplicador de onda de choque. Para o acoplamento entre essa membrana e a transmissão aplicador de ultra-som gel tem de ser usado. O banho de água é cheio com água desgaseificada, para evitar a cavitação que poderia ocorrer se o gás se dissolva na água. Um aquecedor na parte inferior com um sensor de temperatura ligado a uma unidade de controlo permite regular a temperatura para a imitação de condições in vivo e culturas de células, para evitar a arrefecer durante o procedimento. A temperatura pode ser mantida estável a 37 graus centígrados, como é feito em uma incubadora. Um suporte para as amostras de células permite a imersão de qualquer tipo de frasco de cultura ou do tubo. Desse modo, o recipiente da amostra tem de ser completamente cheio com o meio de cultura, como bolhas de ar iria bloquear ondas de choque! Um absorvedor em forma de cunha para a parede traseira da banheira destructs ondas, a fim de não se correr e reflectida de volta, para evitar a interferência. Uma vantagem adicional para outros modelos IVSWT é a possibilidade de variar a distância entre o aplicador e dos frascos de cultura. Apreciação do nosso grupo e outros que usam este modelo é claramentecomo que cada tipo de célula reage muito especificamente a diferentes parâmetros de tratamento. Além disso, a definição da distância entre a fonte de ondas e a amostra é crucial, uma vez que permite controlar as células a ser numa posição específica em relação ao foco do aplicador de ondas de choque.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2002">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Orthogold shock wave device</td>
			<td colspan="2" style="width:756px;">Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA &#8211; manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany</td>
			<td style="width:827px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">IVSWT Water Bath V2.0</td>
			<td style="width:537px;">Johann Hohenegger - Technical Products</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&#38;Growth Factors</td>
			<td style="width:537px;">Lonza</td>
			<td style="width:219px;">CC-3156 &#38; CC-4176</td>
			<td>This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"><a href="http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html">Pechiney&#160;Parafilm M PM996</a></td>
			<td style="width:537px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PH-LF-PM996-EA at labplanet.com</td>
			<td>for sealing flasks</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Falcon Serological pipets 25ml</td>
			<td style="width:537px;">Becton Dickinson Labware</td>
			<td style="width:219px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">CellMate II Serological Pipette&#160;</td>
			<td style="width:537px;">Matrix Technologies</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">Skintact Ultrasonic Gel</td>
			<td style="width:537px;">Skintact</td>
			<td style="width:219px;">UL-01 250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">T25 cell culture flasks</td>
			<td style="width:537px;">COSTAR</td>
			<td style="width:219px;">3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">mikrozid disinfectant</td>
			<td style="width:537px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:219px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">3,5l degassed water</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:420px;">paper towels</td>
			<td style="width:537px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shock wave application to cell cultures

As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Resultados da investigação básica mostrou que as ondas de choque causam um estímulo biológico para atingir as células ou tecidos, sem qualquer dano subseqüente. Portanto, experimentos in vitro são de interesse crescente. Vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células. No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? A diferença da impedância acústica do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se reflete! Assim, desenvolvemos um modelo que consiste principalmente de um recipiente construído de Plexiglas que permite que as ondas se propagam para dentro da água, depois de passar a cultura de células. Isto evita o efeito de cavitação, bem como a reflexão das ondas que, de outra forma perturbam os próximos. Wiª este modelo somos capazes de imitar as condições in vivo e, assim, ganhar mais e mais conhecimento sobre como o estímulo físico de ondas de choque é traduzido em um sinal célula biológica (&quot;mechanotransduction&quot;).

Usando o método descrito foi aplicado ondas de choque às células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) que dantes isolado a partir de cordão umbilical. Cordões umbilicais foram obtidos a partir de cesarianas eletivas. HUVECs foram tratados em uma confluência de 90% em um frasco de cultura de células T25 com um sistema de terapia de ondas de choque eletro-hidráulico. Parâmetros de tratamento eram uma densidade de fluxo de energia de 0,1 mJ / mm 2 e uma freqüência ...

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Shock Wave Application to Cell Cultures

As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Portanto experimentos in vitro são de interesse crescente. Por isso, desenvolvemos um modelo in vitro para estudos de ondas de choque (IVSWT) que nos permite simular as condições in vivo, evitando assim efeitos físicos distracção.

Choque aplicação de ondas de culturas de células

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

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12.6K visualizações.  Innsbruck Medical University.  As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Portanto experimentos in vitro são de interesse crescente. Por isso, desenvolvemos um modelo in vitro para estudos de ondas de choque (IVSWT) que nos permite simular as condições in vivo, evitando assim efeitos físicos distracção. 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Engenharia de Tecidos de tumor estromal Microenvironment com Aplicação a invasão Cancer Cell

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

Grande área varredura sonda Nanolitografia facilitada pelo alinhamento automatizado e sua aplicação para fabricação de substrato para estudos de cultura celular

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...