The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Line Generación <ol><li> Generar dos construcciones diferentes. En la primera construcción, ADNc RpL10A (proteína ribosomal subunidad L10A) se clona aguas abajo de las buenas prácticas agrarias en el plásmido UPAEP-PL-GFP-Nter (versión modificada de 32). El uso de un promotor de la línea germinal permite un uso más polivalente de la línea transgénica. NOTA: Obtener el segundo constructo clonando la secuencia reguladora que dirige la expresión específica de tejido del gen se queda atrás aguas arriba de GAL4 (TF) utilizando el plásmido pPTGAL4. </li><li> Inyectar plásmidos por separado en w 1118 moscas e insertar los constructos en el genoma de la mosca de la inserción del elemento P (de acuerdo con el procedimiento estándar) 33. </li><li> Seleccione transformantes para recuperar líneas de vuelo con construcciones en dos cromosomas diferentes. La línea de TRAP final se crea mediante la combinación de estas dos líneas (cruces genéticos) con el fin de obtener una línea estable de doble transgénico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificar esta línea y recoger los embriones protagonizadas deseado. </li></ol> 2. Embryo Collection <ol><li> Preparar 8 grandes jaulas de población cilíndricos que contienen alrededor de 40 g de moscas jóvenes por jaula (alrededor de 180,000 moscas / jaula). </li><li> Proceda con los llamados pre-Lays que permiten a las moscas para borrar los embriones en desarrollo de sus oviductos. Para ello, sentar las moscas para 1 hr en dos platos Petri de 11 cm de diámetro que contienen una mezcla de agar y zumo de uva solidificada y cubrir ⅓ de la superficie con pasta de levadura recién hecho. Después de 3 intercambios de uva placas jugo recogen los embriones reales en platos recién hechos similares. NOTA: El tiempo de incubación variará de acuerdo con el desarrollo de ventana de tiempo estudiado. </li><li> Retire las placas de las jaulas y dejarlos a la misma temperatura durante el tiempo necesario para obtener el grado de desarrollo correcto (por ejemplo, 3 horas de la puesta de huevos + 10 h de Additincubación ional da embriones de etapa de 10 a 13 horas después de la puesta de huevos (AEL)). Resuspender el contenido de la placa (embriones, pasta de levadura, moscas muertas) con 50 ml de agua utilizando un cepillo. </li><li> Ir a través de una serie de tamices (700 m, 355 m, 112 m) para separar los embriones de moscas muertas y demás partes del cuerpo y recoger embriones retenidos en el tamiz de menor diámetro, y luego lavar brevemente en agua destilada. No utilice más de 18 planchas por la colección, ya que puede obstruir los tamices. </li><li> Embriones Dechorionate en 4,5% de lejía en agua desionizada durante 2 minutos y enjuagar bien con agua desionizada durante 30 a 60 segundos. Incubar los embriones en PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml de cicloheximida, durante 5-10 min a RT bajo agitación. </li><li> Embriones secos en hojas absorbentes de celulosa y transferirlas a tubos de microcentrífuga. Pesar los tubos y el flash-congelar los embriones por inmersión en nitrógeno líquido. En esta etapa, los embriones secos se pueden almacenar durante varios meses a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparación de perlas magnéticas acopladas a GFP de anticuerpos <ol><li> Completamente resuspender la proteína G cuentas magnéticas en la botella original de agitación suave. </li><li> Transferencia de 90 l de perlas a un tubo de RNasa libre y recogerlos en un imán (30-60 seg). 90 l de perlas es necesario llevar a cabo la inmunoprecipitación (IP) con 1 ml de lisado que contienen el 60-80 mg / ml proteínas. Respetar las proporciones para evitar la saturación del grano. Utilice varios tubos de acuerdo con la cantidad de proteínas. </li><li> Bolas de lavado con 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 l) y recolectar los granos en el imán para desechar el sobrenadante. Añadir 30 g de anticuerpo GFP en 350 l de PBS 0,01% Tween 20 a las perlas y se incuba con el extremo lento sobre el extremo de mezclar durante 30 min a TA. </li><li> Recoger los granos en el imán (30-60 seg), desechar el sobrenadante y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cicloheximida 100 g / ml , Protease inhibidor 1 ×, inhibidor de RNasa 100 U). </li><li> Recoger los granos en el imán y añadir 500 l de tampón de bloqueo (BSA 0,1 mg / l, ARNt de levadura 0,1 g / l, glucógeno 0,1 g / l en tampón de extracción polisomas). </li><li> Incubar durante 30 min a TA y repetir este paso una vez con tampón de bloqueo fresco. </li><li> Recoger los granos en el imán y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas, a continuación, recordar cuentas y proceder de inmediato a la etapa inmunopurificación (artículo 6). </li></ol> 4. Preparación de lisado <ol><li> Antes de iniciar, configurar el programa en el multi-direccional cuentas de velocidad rápida grinder: 2 × 10 segundos a 5000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferencia de embriones secos (1,5 g) a tubos de 15 ml previamente enfriado en hielo que contiene tampón de extracción polisomas, y homogeneizar inmediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriones en 4 ml de tampón de extracción polisomas. </li><li> Spread homogeneizada embriones de cada dos preenfriados 2 tubos mL y muelen el embryos ejecutando el programa homogeneizador. Transferir el lisado a tubos de microcentrífuga frescos previamente enfriado en hielo y preparar un sobrenadante postnuclear por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 2000 g. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de preenfriado fresco en hielo, añadir un centésimo volumen de muestra de 10% Nonidet P-40 al sobrenadante (concentración final = 0,1%), y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Pulse-centrífuga la muestra en un Minifuge para recoger el líquido en la parte inferior del tubo, añadir un noveno volumen de muestra de 300 mM de 1,2-sn-Diheptanoyl-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentración final = 30 mM ), mezclar suavemente invirtiendo el tubo, y se incuba la mezcla en hielo durante 5 min (mezcla invirtiendo varias veces durante la incubación). </li><li> Preparar el sobrenadante post-mitocondrial por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir la concentración de proteína por el método de Bradford: concentración en lisado debe estar entre el 60-80 mg / ml. Take el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado fresco y proceder de inmediato a la etapa de pre-absorción (sección 5). </li></ol> 5. Pre-absorción <ol><li> Completamente resuspender las perlas magnéticas por agitación suave y la transferencia de 30 l de perlas en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente (30 l de perlas / 1 ml de lisado embrionaria). </li><li> Recoger los granos en el imán, pipeta el sobrenadante, y resuspender las perlas en tampón de extracción polisomas (500 l). Recoger los granos en el imán, añadir lisado embrionario, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C en un rotador. <ol><li> Eliminar cuentas y mantener sobrenadante en hielo durante la etapa inmunopurificación. Antes inmunopurificación, mantenga 100 l de sobrenadante (de entrada) para comparar la muestra mundial de ARN con la muestra de ARN recogido después inmunopurificación, por RT-qPCR por ejemplo. </li></ol></li></ol> 6. La inmunopurificación <ol><li> Añadir 1 ml (correspondiente a un 60-80 mg / ml de proteína) delisado pre-absorbido a un tubo de RNasa libre que contiene 90 l de cuentas bloqueadas acoplados a anticuerpos GFP. Incubar las muestras a 4 ° C durante 2 horas con suave mezclado de extremo a extremo en un rotador tubo. Alternativamente, realice la incubación O / N a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, recoger los granos en el imán. Utilice un Minifuge a girar hacia abajo las perlas, a continuación, volver a suspender en 500 l de tampón de lavado (Hepes 10 mM, KCl 350 mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cicloheximida 100 mg / ml, RNasa inhibidor de 100 U ) y recogerlos en el imán. Repita este paso dos veces más. </li><li> Cambiar las perlas a un nuevo tubo RNasa libre de preenfriado y lavar dos veces. Recoge las cuentas de un imán y proceder a la extracción de ARN mediante la adición de 1 ml de Trizol directamente a las cuentas y seguir las instrucciones del fabricante. </li></ol> 7. ARN Limpieza y Evaluación de la Calidad <ol><li> Utilice un Kit RNeasy Micro según las instrucciones del fabricante. Al finalizar, elute ARN con (x) l de agua libre de RNasa. Caliente durante 2 minutos a 60 ° C, y la tienda de complemento congeladas muestras a -80 ° C. Compruebe la calidad del ARN utilizando bioanalizador (siga las instrucciones del fabricante). </li><li> Para probar la especificidad de la Traped ARN, lleve a cabo la transcripción inversa en 3 ng de ARN purificado (de entrada y de IP) según las instrucciones del fabricante (superíndice III). Utilice el ADNc obtenido para qPCR utilizando conjuntos de cebadores específicos del gen. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo se describe un protocolo de purificación Traducción ribosoma Affinity modificado (apodado &#39;TRAP-rc&#39;) dedicado al estudio de las poblaciones de células raras en embriones de Drosophila. Se proporciona información sobre los pasos clave para el aislamiento exitoso de ARN específico con un rendimiento adecuados para microarray o análisis de ARN-ss, es decir, 1) la cantidad de material biológico requerido y procedimiento optimizado para la lisis de embriones y la extracción de polisomas; 2) cuentas / anticuerpo-to-lisado ratios para inmunoprecipitación óptima; 3) los pasos que permite la reducción del fondo incluyendo la composición de tampón de lavado con el fin de ejecutar experimentos-TRAP rc con alta especificidad y sensibilidad. Este protocolo produce datos reproducibles por lo que es aplicarse fácilmente a otros tipos de células. Esta técnica hace que sea posible analizar la expresión génica diferencial en el nivel de mRNA activamente-traducción y por lo tanto preparar el camino para la comprensión de la expresión de proteínas en una especificación<html> tipo de célula ific a una ventana de tiempo específica. Tenga en cuenta sin embargo, que la abundancia de proteínas dependerá de la velocidad de los procesos de traducción y la degradación. Una limitación importante del método TRAP es su incapacidad para medir el contenido de proteína de una manera cuantitativa precisa o para detectar modificación post-traduccional. La mejora de la cuantificación mediante la medición de la densidad de los ribosomas a lo largo del cuerpo de ARNm y, al hacerlo, de una manera específica del tipo celular puede hacer trampa en combinación con ribosoma footprinting una herramienta muy poderosa. En un trabajo reciente 34, esta combinación se realizó en las células embrionarias humanas de riñón 293. Los autores corrieron footprinting nucleasa seguido de purificación por afinidad de una forma biotinilada inducible de RpL10A usando perlas de estreptavidina. Esta es una prueba de principio de que es posible llevar a cabo la huella de ribosomas en un organismo completo mientras que apunta un tipo celular específico, la limitación es la cantidad de material biológico necesario para el propósito. &quot;&gt; Realizando experimentos TRAP en paralelo con los análisis transcriptomic globales permitirá realizar un seguimiento de proporciones entre los recién transcrita y actively- traducir ARN. Este será profundamente informativa de los posibles mecanismos post-transcripcional que tienen lugar en contextos específicos del desarrollo o poblaciones de células específicas microRNAs -por por ejemplo. En conclusión, TRAP es un método altamente eficiente, específico y sensible para identificar RNAs activamente unidos a los ribosomas-traducción de una manera específica de la célula. Este método se puede utilizar en una amplia variedad de organismos y tipos de tejidos. El nuevo protocolo de TRAP-rc descrito aquí se ha optimizado para las poblaciones de células raras (menos de 1% del número total de células) y de una cantidad de material final suficiente para los análisis posteriores a nivel de todo el genoma. Una posible limitación de este método es la exigencia de un fuerte impulsor de producir ribosomas etiquetados en cantidad suficiente para compensarmeete con los no etiquetados endógenos en el tipo de célula diana. En un estudio reciente 25, los autores estiman en 10-30% la proporción de etiquetado frente a ribosomas sin etiquetar. Para superar este problema cada vez mayor número de copias-EGFP UAS-RpL10A debería mejorar considerablemente este equilibrio. Alternativamente, añadiendo a los antecedentes genéticos se describe un transgén UAS-GAL4 amplificará la producción de la proteína GAL4 e indirectamente aumentar la expresión de RpL10A-EGFP. Esto debería favorecer una mejor ocupación de los ribosomas etiquetados en ARNm. Tenga en cuenta que este enfoque ya eficiente se puede hacer aún más potente mediante la adaptación de los métodos complementarios para traer un aspecto más cuantitativa o para descubrir y desentrañar los mecanismos moleculares que son esenciales para el control de la expresión génica.

La comprensión de cómo las células adquieren propiedades específicas durante el desarrollo es crucial para poder apreciar la complejidad de los órganos y su posible evolución hacia condiciones patológicas. Hay un gran impulso de investigación para descifrar las redes reguladoras de genes que subyacen en la especificación y diferenciación celular por perfiles de expresión génica global unrevealing, el estado de unión Pol II, factor de transcripción de ocupación en secuencias reguladoras o modificaciones post-traduccionales de las histonas. Para evaluar la expresión de genes en una microarrays nivel mundial y se utilizan enfoques de ARN-ss. Microarrays permiten detectar la abundancia de ARNm, mientras que el ARN-ss es mejor orientado a informar sobre los diferentes tipos de ARN, incluyendo codificación y noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs o snARNs. Sin embargo, estas técnicas no pueden diferenciar activamente transcritas-, en estado estacionario de ARNm, la traducción de ARNm-activamente, y el ARNm de entrar en el proceso de degradación. La medición constante-stcomieron los niveles de mRNA se sabe que es un pobre estimación de la composición proteoma a 1-3. Por el contrario, la identificación de forma activa-traducción de ARNm da una imagen más precisa de la producción de proteínas. Sin embargo, los estudios de transcriptómica principalmente se han dirigido a nivel de todo el organismo mediante la comparación de la ganancia o pérdida de la función de un factor específico a la condición de tipo salvaje 4-7 o en el tejido diseccionado, por lo que los perfiles de expresión génica de difícil interpretación. Los recientes avances en instrumentos de focalización de células, purificación por afinidad y mejoras de sensibilidad permiten ahora para llevar a cabo los análisis de todo el genoma en las poblaciones de células pequeñas o células individuales incluso en un organismo vivo. En Drosophila, grandes colecciones de líneas transgénicas permiten la orientación temporal y espacial específica de diferentes tejidos y las subpoblaciones de células a través del sistema GAL4 / UAS 8-10 obteniéndose la cuantificación más precisa de los mecanismos moleculares requeridos para la función celular. RNA-11. Este método basado en sacarosa centrifugación en gradiente permite la selección de la fracción polisomas y la determinación de ARNm traducido en todo el genoma cuando se analizaron con microarrays o secuenciación de profundidad. Polisoma aislamiento se puede acoplar con la digestión nucleasa para identificar huellas ribosomal correspondientes a fragmentos de ARN protegidos por los ribosomas durante el proceso de traducción 12. Footprinting Ribosomal aumenta la precisión de la cuantificación de la traducción del ARN y ARN resolución a nivel de secuencia y posicionamiento ribosoma, hace que sea posible medir la frecuencia de la traducción. Sin embargo, hasta la fecha no se ha aplicado al aislamiento de células específicas de translatomes, principalmente debido a la fuerte disminución en el rendimiento de ARN obtenido al final del proceso de footprinting ribosoma. Dado que la selección de tamaño de ARN puede generar potencial de falsos positives de diferentes RNPs que también podrían estar protegiendo ARN de una manera similar, se necesitan nuevos avances para mejorar la huella ribosomal y adaptarlo a los enfoques específicos de células. Uno de tales métodos, llamado el Translating ribosoma Purificación por Afinidad (TRAP) ha sido descrita en 2008 por Heiman et al. y aplicado para aislar el translatome de un subconjunto de neuronas en ratones. Por epítopo etiquetado una proteína ribosomal de una manera específica del tipo celular, polisomas se pueden purificar selectivamente sin la etapa laboriosa de disociación celular y la clasificación. En este caso, los 60S proteína ribosómica L10A en la superficie de los ribosomas fue etiquetado con eGFP 13. Desde 2008, varios estudios han utilizado este método en diferentes especies, a partir de ratones 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 pez cebra y Arabidopsis thaliana 24. El método TRAP también ha sido adaptada al modelo de Drosophila y utilizado a Purify ARNm a partir de células neuronales y astrocitos 26 25 específicos de tipo celular. Se utilizó el sistema GAL4 / UAS binaria versátil para expresar RpL10A-GFP etiquetados de una manera específica de tejido. Jefes de las moscas adultas fueron disecados para realizar la selección polisoma de células neuronales (dirigidos por pan-neuronal conductor Elav-Gal4) y ARN aislados fueron secuenciados. El gran número de genes regulados correspondió a los conocidos por ser expresado en el sistema nervioso, lo que indica que el enfoque tiene buena especificidad y nos impulsa para adaptarlo a las poblaciones de células raras (menos de 1% de las células) presentes en el desarrollo de embriones de Drosophila . Dentro del modelo de Drosophila, la etapa embrionaria es un modelo de elección para el estudio de los procesos de desarrollo, como los actores moleculares y movimientos morfogenéticos se conservan evolutivamente. Los enfoques transcriptomic solamente tejidos específicos llevados a cabo hasta la fecha en este modelo se han realizado usando celular o nuclear por lorting y sólo han podido estudiar transcriptoma en estado estacionario 27 a 31, creando la necesidad de métodos dedicados al tejido / translatome perfil específico de las células en el embrión de la mosca. Aquí mostramos el primer protocolo TRAP dedicada a los embriones de Drosophila. Con este método, enganchado-in-traducción del ARNm en una población celular muy restringido de alrededor de 100 células musculares por embrión se aisló con éxito con alta calidad y especificidad. El sistema binario GAL4 / UAS se utiliza para conducir la expresión de RpL10A GFP-etiquetados en subpoblación de músculos sin ninguna toxicidad, no hay fenotipos aparentes o retraso en el desarrollo como se indica anteriormente 25. Embriones de Drosophila poseen 30 músculos por hemisegment que darán lugar a la musculatura de la larva. Mediante el uso de una región reguladora descubierto en las proximidades del gen de identidad se queda atrás, 6 de los 30 músculos multi-nucleadas están dirigidos. En este ensayo, los ribosomas se inmovilizan en el ARNm usando el alargamiento traduccióninhibidor cicloheximida. Extractos citosólicos se utilizan entonces para purificación por afinidad con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo GFP. Calidad de ARN purificado fue validado utilizando bioanalizador. Quantitative PCR de transcripción inversa (RT-qPCR) se utilizó para determinar la especificidad y la sensibilidad de aislamiento de mRNA y demostró que nuestro protocolo optimizado es altamente eficiente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

El sistema muscular somática embrionario de Drosophila está compuesto por 30 músculos por hemisegment, y cada músculo tiene un conjunto específico de propiedades: el código de los genes de identidad, posición, número de eventos de fusión, sitios de fijación y la inervación. Identificar traducida del ARNm en un subconjunto específico del músculo dará información sobre las proteínas necesarias para formar estas características musculares específicos. Utilizando el método basado en la TRAP, ARN a partir de una subpoblación de los músculos que expresan el gen se queda atrás identidad se purificó (Figura 1A-B). Una preocupación importante de este enfoque es la calidad y la especificidad de la ARN aislado. El protocolo optimizado informó aquí habilitada la recuperación sistemática de ARN de alta calidad evaluados con el análisis bioanalizador. El perfil obtenido muestra ninguna degradación del ARN (Figura 1C). En otros estudios desarrollados en torno al método TRAP, se plantearon cuestiones sobre la especificidad de los datos. Aquí iejorar el método para suprimir el fondo ligado a la unión no específica del ARN a las perlas o los tubos y por la optimización de la solución tampón de lavado. Con el fin de evaluar el nivel y la eficacia de aislamiento de células que expresan slouch fondo, nos llevó ensayos RT-qPCR en 3 repeticiones de la misma etapa embrionaria. Doblar-enriquecimientos de 4 genes diferentes (MEF2, se queda atrás, prospero, soxNeuro) se calcularon en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32 (Figura 1D). Estos resultados mostraron enriquecimiento de 2,3 veces de pan-musculares MEF2 genes y enriquecimiento de 5,6 veces del gen se queda atrás. En contraste, los dos genes expresados ​​en el sistema neural se empobrecido en comparación con la entrada. Se observaron valores de cambio veces muy similares en 3 repeticiones biológica, lo que demuestra que el protocolo es robusto. Con conductor Slouch-Gal4 y partiendo de 1,5 g, alrededor de 1,5x10 ^ 6 embriones fueron obtenidos que contienen 100 células GFP / embrión (un total de 150 × 10 ^ 6 positivocélulas). Después de ejecutar el experimento TRAP, el rendimiento es de alrededor de 25 a 45 ng de ARN específico dependiendo de la etapa de intereses. Este material es suficiente para hacer funcionar el análisis de microarrays o RNA-Seq usando un protocolo de amplificación para construir una biblioteca de ARN-ss. Eficiencia dependerá en gran medida de la fuerza del conductor utilizado para expresar RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. Calidad y evaluación especificidad de ARN TRAP-aislado de Slouch-GAL4&gt; embriones UASRpL10A-EGFP. (AB) Confocal de imágenes de un embrión de etapa-16 que muestra la expresión RpL10A-EGFP específicamente en las seis células musculares Slouch por hemisegment (A). Co-localización de RpL10A-EGFP con el Beta3tubulin generales marcador muscular se observa en la foto de combinación (B). (C) Control de calidad de Traped ARN ran en bioanalizador mostrando perfecta integridad de ARNr 18S y 28S. Análisis (D) RT-qPCR mostrando una alta especificidad de experimentos de mRNA TRAP aislado en 3 réplicas biológicas de etapa-16 embriones. Doblar el cambio se calcula en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32. MEF2 transcripciones presentes en todos los linajes musculares son enriquecidos en 2,3 veces en comparación con la entrada, mientras que las transcripciones slouch más restringidas son 5,6 veces enriquecido. Células neuronales que expresan prospero y genes soxN se agotan 2,2 veces y 5,5 veces, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K vistas.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Investigación

Biología

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...