The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Line Generación <ol><li> Generar dos construcciones diferentes. En la primera construcción, ADNc RpL10A (proteína ribosomal subunidad L10A) se clona aguas abajo de las buenas prácticas agrarias en el plásmido UPAEP-PL-GFP-Nter (versión modificada de 32). El uso de un promotor de la línea germinal permite un uso más polivalente de la línea transgénica. NOTA: Obtener el segundo constructo clonando la secuencia reguladora que dirige la expresión específica de tejido del gen se queda atrás aguas arriba de GAL4 (TF) utilizando el plásmido pPTGAL4. </li><li> Inyectar plásmidos por separado en w 1118 moscas e insertar los constructos en el genoma de la mosca de la inserción del elemento P (de acuerdo con el procedimiento estándar) 33. </li><li> Seleccione transformantes para recuperar líneas de vuelo con construcciones en dos cromosomas diferentes. La línea de TRAP final se crea mediante la combinación de estas dos líneas (cruces genéticos) con el fin de obtener una línea estable de doble transgénico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificar esta línea y recoger los embriones protagonizadas deseado. </li></ol> 2. Embryo Collection <ol><li> Preparar 8 grandes jaulas de población cilíndricos que contienen alrededor de 40 g de moscas jóvenes por jaula (alrededor de 180,000 moscas / jaula). </li><li> Proceda con los llamados pre-Lays que permiten a las moscas para borrar los embriones en desarrollo de sus oviductos. Para ello, sentar las moscas para 1 hr en dos platos Petri de 11 cm de diámetro que contienen una mezcla de agar y zumo de uva solidificada y cubrir ⅓ de la superficie con pasta de levadura recién hecho. Después de 3 intercambios de uva placas jugo recogen los embriones reales en platos recién hechos similares. NOTA: El tiempo de incubación variará de acuerdo con el desarrollo de ventana de tiempo estudiado. </li><li> Retire las placas de las jaulas y dejarlos a la misma temperatura durante el tiempo necesario para obtener el grado de desarrollo correcto (por ejemplo, 3 horas de la puesta de huevos + 10 h de Additincubación ional da embriones de etapa de 10 a 13 horas después de la puesta de huevos (AEL)). Resuspender el contenido de la placa (embriones, pasta de levadura, moscas muertas) con 50 ml de agua utilizando un cepillo. </li><li> Ir a través de una serie de tamices (700 m, 355 m, 112 m) para separar los embriones de moscas muertas y demás partes del cuerpo y recoger embriones retenidos en el tamiz de menor diámetro, y luego lavar brevemente en agua destilada. No utilice más de 18 planchas por la colección, ya que puede obstruir los tamices. </li><li> Embriones Dechorionate en 4,5% de lejía en agua desionizada durante 2 minutos y enjuagar bien con agua desionizada durante 30 a 60 segundos. Incubar los embriones en PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml de cicloheximida, durante 5-10 min a RT bajo agitación. </li><li> Embriones secos en hojas absorbentes de celulosa y transferirlas a tubos de microcentrífuga. Pesar los tubos y el flash-congelar los embriones por inmersión en nitrógeno líquido. En esta etapa, los embriones secos se pueden almacenar durante varios meses a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparación de perlas magnéticas acopladas a GFP de anticuerpos <ol><li> Completamente resuspender la proteína G cuentas magnéticas en la botella original de agitación suave. </li><li> Transferencia de 90 l de perlas a un tubo de RNasa libre y recogerlos en un imán (30-60 seg). 90 l de perlas es necesario llevar a cabo la inmunoprecipitación (IP) con 1 ml de lisado que contienen el 60-80 mg / ml proteínas. Respetar las proporciones para evitar la saturación del grano. Utilice varios tubos de acuerdo con la cantidad de proteínas. </li><li> Bolas de lavado con 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 l) y recolectar los granos en el imán para desechar el sobrenadante. Añadir 30 g de anticuerpo GFP en 350 l de PBS 0,01% Tween 20 a las perlas y se incuba con el extremo lento sobre el extremo de mezclar durante 30 min a TA. </li><li> Recoger los granos en el imán (30-60 seg), desechar el sobrenadante y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cicloheximida 100 g / ml , Protease inhibidor 1 ×, inhibidor de RNasa 100 U). </li><li> Recoger los granos en el imán y añadir 500 l de tampón de bloqueo (BSA 0,1 mg / l, ARNt de levadura 0,1 g / l, glucógeno 0,1 g / l en tampón de extracción polisomas). </li><li> Incubar durante 30 min a TA y repetir este paso una vez con tampón de bloqueo fresco. </li><li> Recoger los granos en el imán y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas, a continuación, recordar cuentas y proceder de inmediato a la etapa inmunopurificación (artículo 6). </li></ol> 4. Preparación de lisado <ol><li> Antes de iniciar, configurar el programa en el multi-direccional cuentas de velocidad rápida grinder: 2 × 10 segundos a 5000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferencia de embriones secos (1,5 g) a tubos de 15 ml previamente enfriado en hielo que contiene tampón de extracción polisomas, y homogeneizar inmediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriones en 4 ml de tampón de extracción polisomas. </li><li> Spread homogeneizada embriones de cada dos preenfriados 2 tubos mL y muelen el embryos ejecutando el programa homogeneizador. Transferir el lisado a tubos de microcentrífuga frescos previamente enfriado en hielo y preparar un sobrenadante postnuclear por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 2000 g. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de preenfriado fresco en hielo, añadir un centésimo volumen de muestra de 10% Nonidet P-40 al sobrenadante (concentración final = 0,1%), y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Pulse-centrífuga la muestra en un Minifuge para recoger el líquido en la parte inferior del tubo, añadir un noveno volumen de muestra de 300 mM de 1,2-sn-Diheptanoyl-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentración final = 30 mM ), mezclar suavemente invirtiendo el tubo, y se incuba la mezcla en hielo durante 5 min (mezcla invirtiendo varias veces durante la incubación). </li><li> Preparar el sobrenadante post-mitocondrial por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir la concentración de proteína por el método de Bradford: concentración en lisado debe estar entre el 60-80 mg / ml. Take el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado fresco y proceder de inmediato a la etapa de pre-absorción (sección 5). </li></ol> 5. Pre-absorción <ol><li> Completamente resuspender las perlas magnéticas por agitación suave y la transferencia de 30 l de perlas en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente (30 l de perlas / 1 ml de lisado embrionaria). </li><li> Recoger los granos en el imán, pipeta el sobrenadante, y resuspender las perlas en tampón de extracción polisomas (500 l). Recoger los granos en el imán, añadir lisado embrionario, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C en un rotador. <ol><li> Eliminar cuentas y mantener sobrenadante en hielo durante la etapa inmunopurificación. Antes inmunopurificación, mantenga 100 l de sobrenadante (de entrada) para comparar la muestra mundial de ARN con la muestra de ARN recogido después inmunopurificación, por RT-qPCR por ejemplo. </li></ol></li></ol> 6. La inmunopurificación <ol><li> Añadir 1 ml (correspondiente a un 60-80 mg / ml de proteína) delisado pre-absorbido a un tubo de RNasa libre que contiene 90 l de cuentas bloqueadas acoplados a anticuerpos GFP. Incubar las muestras a 4 ° C durante 2 horas con suave mezclado de extremo a extremo en un rotador tubo. Alternativamente, realice la incubación O / N a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, recoger los granos en el imán. Utilice un Minifuge a girar hacia abajo las perlas, a continuación, volver a suspender en 500 l de tampón de lavado (Hepes 10 mM, KCl 350 mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cicloheximida 100 mg / ml, RNasa inhibidor de 100 U ) y recogerlos en el imán. Repita este paso dos veces más. </li><li> Cambiar las perlas a un nuevo tubo RNasa libre de preenfriado y lavar dos veces. Recoge las cuentas de un imán y proceder a la extracción de ARN mediante la adición de 1 ml de Trizol directamente a las cuentas y seguir las instrucciones del fabricante. </li></ol> 7. ARN Limpieza y Evaluación de la Calidad <ol><li> Utilice un Kit RNeasy Micro según las instrucciones del fabricante. Al finalizar, elute ARN con (x) l de agua libre de RNasa. Caliente durante 2 minutos a 60 ° C, y la tienda de complemento congeladas muestras a -80 ° C. Compruebe la calidad del ARN utilizando bioanalizador (siga las instrucciones del fabricante). </li><li> Para probar la especificidad de la Traped ARN, lleve a cabo la transcripción inversa en 3 ng de ARN purificado (de entrada y de IP) según las instrucciones del fabricante (superíndice III). Utilice el ADNc obtenido para qPCR utilizando conjuntos de cebadores específicos del gen. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo se describe un protocolo de purificación Traducción ribosoma Affinity modificado (apodado &#39;TRAP-rc&#39;) dedicado al estudio de las poblaciones de células raras en embriones de Drosophila. Se proporciona información sobre los pasos clave para el aislamiento exitoso de ARN específico con un rendimiento adecuados para microarray o análisis de ARN-ss, es decir, 1) la cantidad de material biológico requerido y procedimiento optimizado para la lisis de embriones y la extracción de polisomas; 2) cuentas / anticuerpo-to-lisado ratios para inmunoprecipitación óptima; 3) los pasos que permite la reducción del fondo incluyendo la composición de tampón de lavado con el fin de ejecutar experimentos-TRAP rc con alta especificidad y sensibilidad. Este protocolo produce datos reproducibles por lo que es aplicarse fácilmente a otros tipos de células. Esta técnica hace que sea posible analizar la expresión génica diferencial en el nivel de mRNA activamente-traducción y por lo tanto preparar el camino para la comprensión de la expresión de proteínas en una especificación<html> tipo de célula ific a una ventana de tiempo específica. Tenga en cuenta sin embargo, que la abundancia de proteínas dependerá de la velocidad de los procesos de traducción y la degradación. Una limitación importante del método TRAP es su incapacidad para medir el contenido de proteína de una manera cuantitativa precisa o para detectar modificación post-traduccional. La mejora de la cuantificación mediante la medición de la densidad de los ribosomas a lo largo del cuerpo de ARNm y, al hacerlo, de una manera específica del tipo celular puede hacer trampa en combinación con ribosoma footprinting una herramienta muy poderosa. En un trabajo reciente 34, esta combinación se realizó en las células embrionarias humanas de riñón 293. Los autores corrieron footprinting nucleasa seguido de purificación por afinidad de una forma biotinilada inducible de RpL10A usando perlas de estreptavidina. Esta es una prueba de principio de que es posible llevar a cabo la huella de ribosomas en un organismo completo mientras que apunta un tipo celular específico, la limitación es la cantidad de material biológico necesario para el propósito. &quot;&gt; Realizando experimentos TRAP en paralelo con los análisis transcriptomic globales permitirá realizar un seguimiento de proporciones entre los recién transcrita y actively- traducir ARN. Este será profundamente informativa de los posibles mecanismos post-transcripcional que tienen lugar en contextos específicos del desarrollo o poblaciones de células específicas microRNAs -por por ejemplo. En conclusión, TRAP es un método altamente eficiente, específico y sensible para identificar RNAs activamente unidos a los ribosomas-traducción de una manera específica de la célula. Este método se puede utilizar en una amplia variedad de organismos y tipos de tejidos. El nuevo protocolo de TRAP-rc descrito aquí se ha optimizado para las poblaciones de células raras (menos de 1% del número total de células) y de una cantidad de material final suficiente para los análisis posteriores a nivel de todo el genoma. Una posible limitación de este método es la exigencia de un fuerte impulsor de producir ribosomas etiquetados en cantidad suficiente para compensarmeete con los no etiquetados endógenos en el tipo de célula diana. En un estudio reciente 25, los autores estiman en 10-30% la proporción de etiquetado frente a ribosomas sin etiquetar. Para superar este problema cada vez mayor número de copias-EGFP UAS-RpL10A debería mejorar considerablemente este equilibrio. Alternativamente, añadiendo a los antecedentes genéticos se describe un transgén UAS-GAL4 amplificará la producción de la proteína GAL4 e indirectamente aumentar la expresión de RpL10A-EGFP. Esto debería favorecer una mejor ocupación de los ribosomas etiquetados en ARNm. Tenga en cuenta que este enfoque ya eficiente se puede hacer aún más potente mediante la adaptación de los métodos complementarios para traer un aspecto más cuantitativa o para descubrir y desentrañar los mecanismos moleculares que son esenciales para el control de la expresión génica.

La comprensión de cómo las células adquieren propiedades específicas durante el desarrollo es crucial para poder apreciar la complejidad de los órganos y su posible evolución hacia condiciones patológicas. Hay un gran impulso de investigación para descifrar las redes reguladoras de genes que subyacen en la especificación y diferenciación celular por perfiles de expresión génica global unrevealing, el estado de unión Pol II, factor de transcripción de ocupación en secuencias reguladoras o modificaciones post-traduccionales de las histonas. Para evaluar la expresión de genes en una microarrays nivel mundial y se utilizan enfoques de ARN-ss. Microarrays permiten detectar la abundancia de ARNm, mientras que el ARN-ss es mejor orientado a informar sobre los diferentes tipos de ARN, incluyendo codificación y noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs o snARNs. Sin embargo, estas técnicas no pueden diferenciar activamente transcritas-, en estado estacionario de ARNm, la traducción de ARNm-activamente, y el ARNm de entrar en el proceso de degradación. La medición constante-stcomieron los niveles de mRNA se sabe que es un pobre estimación de la composición proteoma a 1-3. Por el contrario, la identificación de forma activa-traducción de ARNm da una imagen más precisa de la producción de proteínas. Sin embargo, los estudios de transcriptómica principalmente se han dirigido a nivel de todo el organismo mediante la comparación de la ganancia o pérdida de la función de un factor específico a la condición de tipo salvaje 4-7 o en el tejido diseccionado, por lo que los perfiles de expresión génica de difícil interpretación. Los recientes avances en instrumentos de focalización de células, purificación por afinidad y mejoras de sensibilidad permiten ahora para llevar a cabo los análisis de todo el genoma en las poblaciones de células pequeñas o células individuales incluso en un organismo vivo. En Drosophila, grandes colecciones de líneas transgénicas permiten la orientación temporal y espacial específica de diferentes tejidos y las subpoblaciones de células a través del sistema GAL4 / UAS 8-10 obteniéndose la cuantificación más precisa de los mecanismos moleculares requeridos para la función celular. RNA-11. Este método basado en sacarosa centrifugación en gradiente permite la selección de la fracción polisomas y la determinación de ARNm traducido en todo el genoma cuando se analizaron con microarrays o secuenciación de profundidad. Polisoma aislamiento se puede acoplar con la digestión nucleasa para identificar huellas ribosomal correspondientes a fragmentos de ARN protegidos por los ribosomas durante el proceso de traducción 12. Footprinting Ribosomal aumenta la precisión de la cuantificación de la traducción del ARN y ARN resolución a nivel de secuencia y posicionamiento ribosoma, hace que sea posible medir la frecuencia de la traducción. Sin embargo, hasta la fecha no se ha aplicado al aislamiento de células específicas de translatomes, principalmente debido a la fuerte disminución en el rendimiento de ARN obtenido al final del proceso de footprinting ribosoma. Dado que la selección de tamaño de ARN puede generar potencial de falsos positives de diferentes RNPs que también podrían estar protegiendo ARN de una manera similar, se necesitan nuevos avances para mejorar la huella ribosomal y adaptarlo a los enfoques específicos de células. Uno de tales métodos, llamado el Translating ribosoma Purificación por Afinidad (TRAP) ha sido descrita en 2008 por Heiman et al. y aplicado para aislar el translatome de un subconjunto de neuronas en ratones. Por epítopo etiquetado una proteína ribosomal de una manera específica del tipo celular, polisomas se pueden purificar selectivamente sin la etapa laboriosa de disociación celular y la clasificación. En este caso, los 60S proteína ribosómica L10A en la superficie de los ribosomas fue etiquetado con eGFP 13. Desde 2008, varios estudios han utilizado este método en diferentes especies, a partir de ratones 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 pez cebra y Arabidopsis thaliana 24. El método TRAP también ha sido adaptada al modelo de Drosophila y utilizado a Purify ARNm a partir de células neuronales y astrocitos 26 25 específicos de tipo celular. Se utilizó el sistema GAL4 / UAS binaria versátil para expresar RpL10A-GFP etiquetados de una manera específica de tejido. Jefes de las moscas adultas fueron disecados para realizar la selección polisoma de células neuronales (dirigidos por pan-neuronal conductor Elav-Gal4) y ARN aislados fueron secuenciados. El gran número de genes regulados correspondió a los conocidos por ser expresado en el sistema nervioso, lo que indica que el enfoque tiene buena especificidad y nos impulsa para adaptarlo a las poblaciones de células raras (menos de 1% de las células) presentes en el desarrollo de embriones de Drosophila . Dentro del modelo de Drosophila, la etapa embrionaria es un modelo de elección para el estudio de los procesos de desarrollo, como los actores moleculares y movimientos morfogenéticos se conservan evolutivamente. Los enfoques transcriptomic solamente tejidos específicos llevados a cabo hasta la fecha en este modelo se han realizado usando celular o nuclear por lorting y sólo han podido estudiar transcriptoma en estado estacionario 27 a 31, creando la necesidad de métodos dedicados al tejido / translatome perfil específico de las células en el embrión de la mosca. Aquí mostramos el primer protocolo TRAP dedicada a los embriones de Drosophila. Con este método, enganchado-in-traducción del ARNm en una población celular muy restringido de alrededor de 100 células musculares por embrión se aisló con éxito con alta calidad y especificidad. El sistema binario GAL4 / UAS se utiliza para conducir la expresión de RpL10A GFP-etiquetados en subpoblación de músculos sin ninguna toxicidad, no hay fenotipos aparentes o retraso en el desarrollo como se indica anteriormente 25. Embriones de Drosophila poseen 30 músculos por hemisegment que darán lugar a la musculatura de la larva. Mediante el uso de una región reguladora descubierto en las proximidades del gen de identidad se queda atrás, 6 de los 30 músculos multi-nucleadas están dirigidos. En este ensayo, los ribosomas se inmovilizan en el ARNm usando el alargamiento traduccióninhibidor cicloheximida. Extractos citosólicos se utilizan entonces para purificación por afinidad con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo GFP. Calidad de ARN purificado fue validado utilizando bioanalizador. Quantitative PCR de transcripción inversa (RT-qPCR) se utilizó para determinar la especificidad y la sensibilidad de aislamiento de mRNA y demostró que nuestro protocolo optimizado es altamente eficiente.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

El sistema muscular somática embrionario de Drosophila está compuesto por 30 músculos por hemisegment, y cada músculo tiene un conjunto específico de propiedades: el código de los genes de identidad, posición, número de eventos de fusión, sitios de fijación y la inervación. Identificar traducida del ARNm en un subconjunto específico del músculo dará información sobre las proteínas necesarias para formar estas características musculares específicos. Utilizando el método basado en la TRAP, ARN a partir de una subpoblación de los músculos que expresan el gen se queda atrás identidad se purificó (Figura 1A-B). Una preocupación importante de este enfoque es la calidad y la especificidad de la ARN aislado. El protocolo optimizado informó aquí habilitada la recuperación sistemática de ARN de alta calidad evaluados con el análisis bioanalizador. El perfil obtenido muestra ninguna degradación del ARN (Figura 1C). En otros estudios desarrollados en torno al método TRAP, se plantearon cuestiones sobre la especificidad de los datos. Aquí iejorar el método para suprimir el fondo ligado a la unión no específica del ARN a las perlas o los tubos y por la optimización de la solución tampón de lavado. Con el fin de evaluar el nivel y la eficacia de aislamiento de células que expresan slouch fondo, nos llevó ensayos RT-qPCR en 3 repeticiones de la misma etapa embrionaria. Doblar-enriquecimientos de 4 genes diferentes (MEF2, se queda atrás, prospero, soxNeuro) se calcularon en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32 (Figura 1D). Estos resultados mostraron enriquecimiento de 2,3 veces de pan-musculares MEF2 genes y enriquecimiento de 5,6 veces del gen se queda atrás. En contraste, los dos genes expresados ​​en el sistema neural se empobrecido en comparación con la entrada. Se observaron valores de cambio veces muy similares en 3 repeticiones biológica, lo que demuestra que el protocolo es robusto. Con conductor Slouch-Gal4 y partiendo de 1,5 g, alrededor de 1,5x10 ^ 6 embriones fueron obtenidos que contienen 100 células GFP / embrión (un total de 150 × 10 ^ 6 positivocélulas). Después de ejecutar el experimento TRAP, el rendimiento es de alrededor de 25 a 45 ng de ARN específico dependiendo de la etapa de intereses. Este material es suficiente para hacer funcionar el análisis de microarrays o RNA-Seq usando un protocolo de amplificación para construir una biblioteca de ARN-ss. Eficiencia dependerá en gran medida de la fuerza del conductor utilizado para expresar RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. Calidad y evaluación especificidad de ARN TRAP-aislado de Slouch-GAL4&gt; embriones UASRpL10A-EGFP. (AB) Confocal de imágenes de un embrión de etapa-16 que muestra la expresión RpL10A-EGFP específicamente en las seis células musculares Slouch por hemisegment (A). Co-localización de RpL10A-EGFP con el Beta3tubulin generales marcador muscular se observa en la foto de combinación (B). (C) Control de calidad de Traped ARN ran en bioanalizador mostrando perfecta integridad de ARNr 18S y 28S. Análisis (D) RT-qPCR mostrando una alta especificidad de experimentos de mRNA TRAP aislado en 3 réplicas biológicas de etapa-16 embriones. Doblar el cambio se calcula en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32. MEF2 transcripciones presentes en todos los linajes musculares son enriquecidos en 2,3 veces en comparación con la entrada, mientras que las transcripciones slouch más restringidas son 5,6 veces enriquecido. Células neuronales que expresan prospero y genes soxN se agotan 2,2 veces y 5,5 veces, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K vistas.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

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Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Investigación

Genética

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Bioquímica

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Biología del Desarrollo

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

RiboTag Inmunoprecipitación en las células germinales del ratón macho

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Biología

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

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TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de

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