Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer.

1. Preparación de cepas madres <ol><li> Hacer reservas de maestros de los compuestos a ensayar en DMSO. Preparar las poblaciones a una concentración estándar de 20 mm. Nota: cualquier concentración superior a 10 mM se puede utilizar. Los compuestos que pueden utilizarse como controles positivos para validar este ensayo incluyen RAL, EVG, y DTG. </li><li> Asegurar los compuestos se disolvieron en DMSO por agitación las soluciones múltiples veces durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Guarde las soluciones madre 20 mM en la oscuridad a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 2. Preparación de las placas de 96 pocillos durante la investigación de compuestos <ol><li> Elija la línea de células para ser probado (por ejemplo, HOS o TZM-bl) y sembrar 100 l de esas células a una densidad de 4 x 10 4 células / ml (4.000 células / pocillo) en medios de comunicación (por ejemplo, modificado Eagle o DMEM medio Dulbecco suplementado con 5% (v / v) de suero fetal bovino, 5% de suero de ternero recién nacido, y penicilina (50 unidades / ml) más estreptomycin). </li></ol> 3. Generación de Virus Stocks Producir VSV-G-pseudotyped VIH mediante la transfección de células 293 (como se muestra en la Figura 1, paso 1) 32-34. <ol><li> El día antes de la transfección, placa 293 células en placas de 100 mm de diámetro a una densidad de 1,5 x 10 6 células. </li><li> En el día de la transfección, transfectar las células 293 con 16 g de tipo salvaje o mutante del VIH (pNLNgoMIVR - ΔLUC) y 4 g de VEV (pHCMV-g) usando el método de fosfato de calcio 35. </li><li> Aproximadamente 6 horas después de la precipitado de fosfato de calcio se añade, lavar las células 293 dos veces con tampón fosfato salino (PBS) y se incuban con medio fresco durante 48 horas. [DMEM suplementado con 5% (v / v) de suero fetal bovino, 5% de suero de ternero recién nacido, y penicilina (50 unidades / ml) más estreptomicina (50 mg / ml)]. </li><li> Se recoge el virus que contiene sobrenadantes mediante la eliminación de los medios de comunicación desde el diámetro 100 mmplatos, aclarar los sobrenadantes por centrifugación a baja velocidad a 3.000 rpm durante 10 min, filtrar los sobrenadantes a través de un filtro de 45 micras de tamaño de poro de la jeringa, el tratamiento de los sobrenadantes con Turbo DNasa durante 30 min a TA y se diluye en los sobrenadantes de los medios de comunicación para la preparación en ensayos de infección . Almacene los sobrenadantes virales congelados, en alícuotas, a -80 ° C. Nota: la cantidad de p24 en el sobrenadante se determina mediante el uso de un kit de ensayo de inmunoabsorción p24 de VIH-1 ligado a enzimas. La concentración de p24 se utiliza para controlar la cantidad de virus en la muestra. Aproximadamente 500 ng de virus se añadió a las células HOS sembradas en placas sobre platos de 60 mm de diámetro a una densidad de 1,5 x 10 5 células / placa en el día antes de la infección. Después de un 48 horas de incubación, las células se cosecharon, recogieron por centrifugación, se lavaron, y se resuspendieron en 100 l de PBS. Añadir una cantidad igual de reportero luminiscencia reactivo de ensayo de genes y medir la actividad luciferasa como se describe en las secciones 5.4.1 y5.4.2. A partir de este, una dilución apropiada de virus se puede hacer como se describe en el paso 4.6. </li></ol> 4. Compuesto Proyección en placas de 96 pocillos Screen cada compuesto por triplicado y promediar los resultados. Nota: el efecto de cada compuesto sobre la replicación viral se corrige mediante la normalización al nivel de la replicación obtenida en ausencia de cualquier compuesto. <ol><li> Determinar el rango de concentración empírica que se proyectarán. Nota: por lo general, las pantallas con 11 diluciones seriadas se realizan añadiendo el compuesto de la columna de platos por columna y pantallas con 7 diluciones seriadas se hacen añadiendo el compuesto por fila. Uno triplicado conjunto de pozos debe ser reservado para el control sin compuesto. Además, una columna o una fila deben permanecer en blanco para actuar como control negativo / fondo. Por último, si se trata de una citotoxicidad celular o ensayo de infectividad dictará si se añade el virus. </li><li> Preparardiluciones en serie a partir de la solución madre 20 mM. Las concentraciones se eligen en función de la gama de concentraciones determinado empíricamente para ser sometidas a ensayo (como se muestra en la Tabla 1). Preparar las diluciones en medios de comunicación en 10 veces la concentración final deseada, es decir, si la concentración final va a ser 100 M, hacer una reserva de trabajo 1 mM. Nota: Los compuestos con IC 50 s por encima de 5-10 M no suelen ser buenos candidatos para el desarrollo de fármacos. En los ensayos iniciales ponemos a prueba los compuestos sólo contra el vector PESO. Compuestos prometedores que inhiben eficazmente el vector PESO entonces se miden frente a un panel de mutantes resistentes a los medicamentos. </li><li> Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora y añadir las diluciones en serie de los compuestos a ensayar a los pocillos en triplicado (como se muestra en la Figura 1, paso 2). Nota: el volumen añadido al pozo debe ser 1/10 de volumen de la concentración final. Por lo tanto, añadir 22 l / pocillo (volumen final pAdemás virus ost es de 220 l) para los ensayos de infectividad. Para los ensayos de citotoxicidad, añadir 11 l / pocillo (volumen final es de 110 l / pocillo). </li><li> Devolver las placas de 96 pocillos a la incubadora. Para una pantalla de citotoxicidad celular, incubar las placas de 96 pocillos 48 horas a 37 ° C y no se necesitan más manipulaciones en el Protocolo 4: continuar con el Protocolo 5 Para los ensayos de infectividad, continúe siguiendo las instrucciones que figuran en el Protocolo 4.. </li><li> Ensayos de infectividad solamente. Retirar las placas de la incubadora después de un mínimo de 3 horas de incubación a 37 ° C con los compuestos a ser analizados. Nota: esto permite que el compuesto para ser absorbido por las células antes de la infección con el vector de VIH. </li><li> Preparar una dilución de stock del virus 33, 34 (por lo general aproximadamente 01:03) que producirá una señal de luciferasa entre 0,2-1,5 unidades relativas de luciferasa (RLU) en células no tratadas. Una placa entera tomará aproximadamente 10 ml de diluciónvirus ted. Añadir 100 l de virus a cada uno de los pozos, utilizando ya sea un 8 o 12 Pipeta multicanal. No agregue virus a los pocillos de control negativo / fondo. Vuelva a poner las placas a la 37 ° C incubadora durante 48 horas. Nota: una acción de dilución del virus 1:03 dilución es típico que producirá una señal de luciferasa entre 0,2 -1,5 RLU basado en un ensayo de p24 demostrando que la concentración viral en el sobrenadante es de aproximadamente 500 ng en 1,0 ml. </li></ol> 5. Preparación y evaluación de la citotoxicidad y la infectividad en placas de 96 pocillos <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de los pozos (rojo fenol en los medios de comunicación puede interferir con la señal de luciferasa). Usar una pipeta de vidrio con una punta de pipeta 200 l unida al extremo. Comience en la parte superior de los medios de comunicación y trabajar poco a poco hacia abajo, hacia la parte inferior del pozo. No gaste demasiado tiempo en el fondo del pozo, o las células pueden ser removidos del pozo. </li><li> Añadir 100 l de PBS suplementado con 0,5 mM de MgCl 2 a cada pocillo. Esto tiene que ser hecho inmediatamente después de que se retiró el medio de manera que las células no se sequen. </li><li> Sólo para los ensayos de citotoxicidad, añadir 5 ml de tampón de sustrato a partir del ensayo de detección de luminiscencia de ATP a cada vial de reactivo liofilizado suministrado. Un vial es suficiente para una placa de 96 pocillos. <ol><li> Añadir 50 l de tampón de lisis celular del ensayo de detección de luminiscencia de ATP a cada pocillo. Agitar la placa de 96 pocillos a 700 rpm a temperatura ambiente durante 5 min utilizando un termomezclador compacto. </li><li> Añadir 50 l de reactivo de ensayo de detección de luminiscencia ATP reconstituido a cada pocillo con excepción de los pozos de control / fondo negativos. Agitar a 700 rpm a temperatura ambiente durante 5 min utilizando un termomezclador compacto. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir tiempo para el desarrollo de la señal. </li><li> Lea la placa de 96 pocillos usando el luminómetro de microplacas. Nota: abrir el programa luminómetro de microplacas SoftMax Pro. Asegúrese de que el luminómetro está configurado para medir luminescence con una sensibilidad de 5 lecturas / pocillo. </li></ol></li><li> Sólo para los ensayos de infectividad, añadir 10 ml de tampón de sustrato a partir del ensayo de gen informador de luminiscencia a cada vial de reactivo liofilizado suministrado. Un vial es suficiente para cada placa de 96 pocillos. <ol><li> Añadir 100 l de reactivo de ensayo reconstituida reportero gen de luminiscencia para cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir tiempo para el desarrollo de la señal. </li><li> Lea la placa de 96 pocillos usando un luminómetro de microplaca como se realizó en la sección 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Determinación de la CC 50 e IC 50 valores para los Compuestos <ol><li> La transferencia de los datos de la luciferasa del luminómetro de microplacas en una hoja de cálculo Excel. <ol><li> Promedio tanto los datos de la luciferasa, por triplicado, y los datos de la señal de fondo / de control. Restar la señal de fondo media / de control de la señal media por triplicado para todo el intervalo de concentración. </li> &lt;Li&gt; normalizar la corrección de fondo a la señal promedio de los intervalos de concentración en contra de la actividad, si se trata de la citotoxicidad o la infectividad, en ausencia de cualquier compuesto para determinar el porcentaje de inhibición. Nota: el porcentaje de inhibición se define como la actividad de la luciferasa en presencia de fármaco dividido por la actividad de la luciferasa en ausencia de fármaco multiplicado por 100. </li></ol></li><li> Utilice el programa de software para obtener Kaleidagraf CC 50 e IC 50 valores <ol><li> Traslado tanto el intervalo de concentraciones determinado empíricamente y la inhibición de la actividad de la luciferasa por ciento en Kaleidagraf. </li><li> Representar gráficamente los datos con el rango de concentración en el eje x y la inhibición de la actividad de la luciferasa por ciento en el eje y. </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un ensayo rápido, eficiente y reproducible que se puede utilizar para seleccionar compuestos para la citotoxicidad y por su capacidad para inhibir la replicación de ambos WT y resistente VIH-1 de drogas. La capacidad de identificar rápidamente compuestos y probar su eficacia y la citotoxicidad es crucial en el desarrollo de nuevos y mejores medicamentos contra el VIH-1. Una vez que se identifican los compuestos de plomo, análogos del compuesto de plomo pueden ser producidos y probados utilizando el mismo ensayo. El ensayo es relativamente simple. Hay dos controles positivos y negativos que permiten al usuario a diagnosticar los problemas más comunes (compuestos tóxicos, problemas con el vector stock). El uso de un conjunto por triplicado de pocillos sin compuesto añadido muestra que se ha producido la infección viral. El hecho de que la citotoxicidad se mide en un ensayo independiente Evita mala interpretación de una reducción de la luciferasa causada por la citotoxicidad como un efecto específico sobre la replicación viral. Los pasos críticosen el protocolo se preparan las placas de manera que las células se distribuyen uniformemente en los pocillos, los pocillos que tienen las concentraciones apropiadas de los compuestos a ensayar, la adición de la misma cantidad de virus a cada uno de los pocillos, y midiendo la actividad de luciferasa a determinar la CC 50 e IC 50 valores. El ensayo es seguro, cuantitativa y reproducible. El ensayo es seguro porque el vector es de replicación defectuosa. El ensayo es cuantitativa y reproducible, ya que se basa en un único vector redondo que expresa luciferasa, que puede ser ensayada con precisión y convenientemente. En un ensayo de replicación del virus ronda múltiples, el CI medido 50 depende del número de ciclos de vida virales; este es un problema particular cuando los ensayos implican ambos WT y los virus resistentes a los fármacos que pueden tener capacidades significativamente diferentes de replicación. Se han realizado varios ensayos enzimáticos informado anteriormente de que puedaser utilizado para la detección de inhibidores de la IN. Los ensayos que implican la tecnología de PCR en tiempo real para medir ADN integrado requieren proteínas recombinantes purificadas (s), y son, en general, tanto más mano de obra intensiva y costosa 36, 37. Aunque es posible utilizar ensayos enzimáticos para medir el impacto de los compuestos sobre las otras enzimas virales (RT y proteasa), cada enzima requiere su propio sistema de ensayo. El ensayo de vector de ronda, como se describe, puede ser utilizado, sin modificación, para la detección de inhibidores de la RT. Un ensayo similar se puede utilizar para la detección de inhibidores de la proteasa; Sin embargo, en un ensayo de inhibidor de la proteasa, los compuestos deben ser añadidos a las células utilizadas para producir los vectores. Un ensayo relacionados, utilizando diferentes células y vectores, también se puede utilizar para la detección de envoltura (env) y los inhibidores de la fusión de entrada del VIH. Por último, el ensayo se puede usar, en una escala más grande, con dispensadores de automatización robótica. Por lo tanto, el ensayo se puede usar para cribar grandes bibliotecas de compuestos contra WT y mutant VIH. Sin embargo, el hecho de el ensayo puede detectar un inhibidor de la replicación del VIH que actúa en diferentes etapas de los puntos ciclo de vida viral a una limitación en la interpretación de los datos. Por sí mismo el ensayo no define lo que paso en el ciclo de vida está bloqueado por un compuesto. Si surge esta pregunta, se puede resolver mediante el uso de tiempo de los ensayos de adición 38, y probando el compuesto contra las proteínas virales recombinantes purificadas. Lamentablemente, a pesar del éxito de los medicamentos contra el VIH, todavía hay problemas con la resistencia y la toxicidad. En ausencia de una vacuna eficaz contra el VIH, hay una necesidad no sólo para desarrollar nuevos fármacos terapéuticos que serán eficaces contra los mutantes resistentes a los fármacos existentes, sino también para desarrollar fármacos profilácticos que pueden reducir la propagación del virus. Si el uso profiláctico de medicamentos contra el VIH comprende el ámbito del tratamiento de las personas infectadas, este enfoque colocará una carga especial en el desarrollo de fármacos que se tienen loco o nada de toxicidad a largo plazo.

La disponibilidad de las drogas dirigidas a varios pasos esenciales en el ciclo vital del virus VIH-1 ha llevado a la terapia de combinación de drogas (llamada terapia altamente activa antirretroviral, o HAART) que ha mejorado en gran medida el tratamiento de las infecciones por el VIH-1, y la supervivencia a largo plazo de los pacientes. TARGA, que típicamente utiliza combinaciones de dos nucleósidos de la transcriptasa inversa (RT) y los inhibidores ya sea un inhibidor de proteasa o un inhibidor no nucleósido de la RT, ahora se ha convertido una enfermedad mortal en una condición de vida larga 1-5. Sin embargo, a pesar de los muchos éxitos de la terapia HAART en una supresión sostenida de la replicación viral, tiene limitaciones. TARGA no erradica el VIH, por lo que los pacientes no se curan y el tratamiento es de por vida. Hay problemas con la toxicidad del fármaco y con la aparición de cepas resistentes a los medicamentos. La resistencia puede surgir de todos los medicamentos contra el VIH aprobados contra, incluidos los medicamentos recientemente aprobados que se dirigen a la integrasa del VIH (IN). Resistencia a los medicamentos probablemente surge becauso de mutaciones espontáneas que se producen durante la replicación viral (tasa de error de 3 x 10 -5 ciclo de mutaciones / base / reproducción) 6. Cuando surgen mutaciones en los genes que codifican para los objetivos de los fármacos anti retrovirales, un pequeño subconjunto de estas mutaciones dará lugar a una reducción en la susceptibilidad de la cepa viral a los medicamentos. Para evitar el desarrollo de resistencia a los medicamentos, las concentraciones de fármacos deben mantenerse en niveles que suprimen totalmente la replicación del VIH. La mala adherencia al régimen terapéutico agrava el problema y puede conducir a la rápida evolución de la resistencia a 7-9. Aunque las concentraciones de fármaco pueden variar en los pacientes debido a la diferente absorción, metabolismo, distribución, y los niveles de excreción, altas concentraciones de drogas pueden conducir a la toxicidad 10. Puesto que la terapia continua para la vida del paciente, hay serias preocupaciones de seguridad acerca de la toxicidad a largo plazo de los antirretrovirales. Los antirretrovirales utilizados en la terapia HAART puede tener efectos adversos and ha habido incidencias donde los efectos secundarios han sido peligrosa para la vida 11-15. Los problemas de los pacientes se encuentran con el desarrollo de la resistencia y toxicidad subyacen a la necesidad de desarrollar nuevos fármacos que bloquean eficazmente la replicación de las cepas resistentes a los medicamentos comunes del virus con una toxicidad escasa o nula a largo plazo. Por lo tanto, hay una necesidad de un ensayo que puede seleccionar compuestos que bloquean los pasos esenciales en el ciclo de vida viral rápidamente. Aquí se describe un ensayo eficiente que se puede utilizar para evaluar la citotoxicidad de un compuestos y su capacidad para bloquear la replicación de ambos WT y cepas de VIH resistentes a los fármacos rápidamente y de manera eficiente. El ensayo se utiliza es similar a un ensayo que fue desarrollado para la detección de resistencia a los medicamentos en el virus aislado de pacientes 16-18. Aunque el ensayo se puede utilizar sin modificación para la detección de compuestos que pueden bloquear la transcripción inversa del VIH, vamos a describe usando el ensayo para evaluar EN inhibidores. EN es una enzima viral esencial que inserta el ADN viral en el genoma celular 19. Aunque se están desarrollando una serie de prometedores en inhibidores, algunos de los cuales están actualmente en fase de ensayos clínicos, sólo Isentress 20, 21 (también conocido como raltegravir o RAL) y, más recientemente, elvitegravir (EVG) 22 y Dolutegravir (DTG) 23 han sido aprobado por la FDA. Estos compuestos son activos contra el VIH tanto B y subtipos no B en cultivo celular y en los pacientes 24, 25. Sin embargo, el tratamiento con RAL selecciona para resistente a los medicamentos del VIH-1 en los mutantes, incluyendo Y143R, N155H y G140S/Q148H 24, 26-31. N155H y G140S/Q148H también reducen la eficacia de EVG, que hace hincapié en la necesidad de diseñar y desarrollar la segunda generación de los inhibidores de transferencia de cadena (INSTIs) que son eficaces contra estas mutaciones de resistencia.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA Filter Unit, 0.45 &amp;micro;M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&amp;Delta;Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Aunque un número de medicamentos contra el VIH se han aprobado, todavía hay problemas con la toxicidad y la resistencia a los medicamentos. Esto demuestra la necesidad de identificar nuevos compuestos que pueden inhibir la infección por los resistentes a los medicamentos del VIH-1 cepas comunes con una toxicidad mínima. Aquí se describe un ensayo eficiente que se puede utilizar para determinar rápidamente la citotoxicidad celular y la eficacia de un compuesto frente a las cepas virales WT y mutantes. La línea celular diana deseada se sembró en una placa de 96 pocillos, y después de una incubación de 24 horas, se añaden seriada diluciones de los compuestos a ensayar. No hay manipulaciones adicionales son necesarios para los ensayos de citotoxicidad celular; para anti VIH Ensayos de una cantidad predeterminada de cualquiera de un WT o VIH-1 resistente vector de medicamento que expresa luciferasa se añade a las células. La citotoxicidad se midió utilizando un ensayo de luminiscencia dependiente de ATP y el impacto de los compuestos sobre la infectividad se mide mediante la determinación de la cantidad de luciferase en la presencia o la ausencia de los inhibidores putativos. Este ensayo de exploración tarda 4 días en completarse y varios compuestos pueden ser examinados en paralelo. Los compuestos se criban por triplicado y los datos se normalizan a los niveles de infectividad / ATP en ausencia de compuestos diana. Esta técnica proporciona una medición rápida y precisa de la eficacia y la toxicidad de los compuestos potenciales anti-VIH.

Si el ensayo (Figura 1, los pasos 1 y 2) se realizó con éxito, entonces los valores de luciferasa deberían ser similares a los datos presentados en la Tabla 2 explorar a través de la gama de concentración.; un compuesto potencialmente potente revelará aumento de la actividad de la luciferasa de izquierda a derecha, y el control debe tener la mayor actividad de la luciferasa. Si la actividad de la luciferasa no supere 0,1 unidades relativas de luciferasa (RLU) en toda la gama de concentración, esto normalmente indica que el compuesto mató a las células. Si los datos de la luciferasa es mayor que o igual a 2,0 RLU a través de todas las diluciones en serie, a continuación, los compuestos no fueron capaces de inhibir el VIH-1 infecciones a las concentraciones ensayadas. Trazado de la concentración de los compuestos frente a la inhibición de la actividad de la luciferasa por ciento en Kaleidagraf (Tabla 3, parte A), después de realizar el análisis de regresión lineal, se producen resultados similares para t<html> manguera se muestra en la Tabla 3, parte B. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Preparación de VIH-1 reservas de virus y de la configuración de la citotoxicidad celular y Single-ronda Infectividad Los ensayos. En el paso 1, las células 293T se transfectan con pNL4.3ΔEnv.LUC y VSV-G y se incubaron durante 48 h para producir el virus 34 . El virus se recoge y se almacena (congelado a -80 ° C en alícuotas) hasta que se utiliza en los ensayos de infectividad. Para el paso 2, células HOS se siembran en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se incubaron previamente con diluciones seriadas de los compuestos a ensayar durante 3 horas y después se infectaron con el virus (ya sea WT o resistente a las drogas). Después de una incubación de 48 horas, se midió la actividad de luciferasa. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabla 1. Selección de Medicamentos de serie de prototipos de dilución. Un examen más riguroso consiste en 11 diluciones en serie que normalmente se inician a los 10 M y desembocan en 0.0005 M. Las diluciones en serie se preparan 10x; hay 100 l de células y 100 l de virus en cada pocillo). En este volumen y siguiendo estos cálculos, las diluciones en serie serán suficientes para 3 filas de una placa entera de 96 pocillos. Los ensayos de citotoxicidad se preparan de manera similar; sin embargo, las 11 diluciones en serie comienzan en 250 M y terminan a las 0.05 mM. Sólo 11 l de las diluciones se añaden a los pocillos en la placa que contiene 100 l de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabla 2. Lectura de datos de la señal de luciferasa y Determinación del porcentaje de inhibición de la actividad luciferasa. La tabla de datos muestra un conjunto típico de datos de la luciferasa para un compuesto éxito. La tabla también muestra los cálculos adicionales necesarios para determinar el porcentaje de inhibición de la actividad de la luciferasa y la CC 50 e IC 50 valores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabla 3. Análisis de Regresión Lineal tabla de datos. Parte A. Representación gráfica de la gama de concentración utilizada en comparación con el porcentaje de inhibición de la actividad de luciferasa en Kaleidagraf producirá las curvas de inhibición apropiadas. Parte B, Las curvas de inhibición se define por la 3 paramétricofunción sigmoidal y ajuste a los datos mediante análisis de regresión lineal 18. Esta tabla de datos se utiliza en conjunción con Microsoft Excel para calcular las concentraciones de fármaco necesaria para inhibir el virus de la integración y la citotoxicidad celular en un 50%, por ejemplo, IC 50 y CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K vistas.  National Cancer Institute.  Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas. 

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Investigación

Genética

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Inmunología e Infección

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Un método de monitoreo asequible VIH-1 Resistencia a los medicamentos para los entornos con recursos limitados

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Medicina

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...