Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NCI unterstützt.

1. Vorbereitung der Master-Aktien <ol><li> Machen Master Aktien der in DMSO-Verbindungen getestet werden. Bereiten Aktien zu einem Standard-Konzentration von 20 mM. Hinweis: jede Konzentration oberhalb von 10 mm verwendet werden. Verbindungen, die als Positivkontrollen verwendet werden kann, um diesen Test zu validieren sind RAL-, EVG und DTG. </li><li> Sicherzustellen, dass die Verbindungen in DMSO durch Vortexen der Lösungen mehrmals für 15 sec und Inkubation bei RT für 1 h gelöst. Bewahren Sie die 20 mM Stammlösungen im Dunkeln bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung der 96-Well-Platten für Komponenten-Screening <ol><li> Wählen Sie die Zelllinie getestet werden (zB HOS oder TZM-bl) und Samen 100 ul dieser Zellen bei einer Dichte von 4 × 10 4 Zellen / ml (4000 Zellen / Vertiefung) in Medien (z. B. Dulbecco-modifiziertem Eagle-oder DMEM-Medium mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Strept ergänztomycin). </li></ol> 3. Erzeugung von Virus-Stocks Erzeugen VSV-G-pseudotypisierten HIV-Zellen durch Transfektion 293 32-34 (wie in Fig. 1, Schritt 1). <ol><li> Am Tag vor der Transfektion Platte 293-Zellen auf 100 mm-Schalen in einer Dichte von 1,5 × 10 6 Zellen. </li><li> Am Tag der Transfektion, Transfektion von 293-Zellen mit 16 ug Wildtyp-oder mutierten HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) und 4 ug VSV (pHCMV-g) unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode 35. </li><li> Etwa 6 Stunden nach der Calciumphosphat-Niederschlag wird aufgenommen, Wasch 293 Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Inkubation mit frischem Medium für 48 Stunden. [DMEM, ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Streptomycin (50 ug / ml)]. </li><li> Ernten Sie den Virus enthaltenden Überstände durch Entfernen der Medien aus dem 100 mm DurchmesserGeschirr, verdeutlichen die Überstände durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 3000 rpm für 10 min, die Überstände filtriert durch ein 45 &amp;mgr; m-Spritzenfilter Porengröße, Behandlung der Überstände mit Turbo DNase für 30 min bei RT inkubiert und die Überstände in verdünnten Medien für die Zubereitung in Infektionstests . Bewahren Sie die Virusüberstände eingefroren, aliquotiert, bei -80 ° C Anmerkung: Die Menge an p24 im Überstand wird mit einem HIV-1-p24-Enzym-Immunoassay-Kits bestimmt. Die p24-Konzentration verwendet wird, die Menge des Virus in der Probe zu steuern. Ungefähr 500 ng Virus zu HOS-Zellen auf 60 mm-Schalen plattiert bei einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen / Schale am Tag vor der Infektion zugesetzt. Nach 48 h Inkubation werden die Zellen geerntet, durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 100 &amp;mgr; l PBS resuspendiert. In die gleiche Menge an Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz und messen Luciferase-Aktivität wie in den Abschnitten 5.4.1 und5.4.2. Daraus kann eine geeignete Verdünnung des Virus, wie in Schritt 4.6 beschrieben werden. </li></ol> 4. Substanz-Screening in 96-Well-Platten Bildschirm jede Verbindung in dreifacher Ausfertigung und der Mittelwert der Ergebnisse. Hinweis: Die Wirkung jeder Verbindung auf die virale Replikation wird durch Normierung auf die Ebene der Replikation in Abwesenheit von Verbindung erhalten wird korrigiert. <ol><li> Bestimmen Sie die Summenkonzentrationsbereich zu sehen sein. Hinweis: in der Regel werden die Bildschirme mit 11 Reihenverdünnungen durch Zugabe der Verbindung zu der Platte Spalte für Spalte und Bildschirme mit sieben serielle Verdünnungen gemacht werden, indem die Verbindung von Zeile vorgenommen. Ein dreifacher Reihe von Brunnen muss für die Verbindung keine Steuer reserviert werden. Darüber hinaus muss eine Spalte oder eine Zeile leer bleiben als negativ / Hintergrundkontrolle handeln. Schließlich sei es eine zelluläre Zytotoxizität oder Infektiosität Assay wird diktieren, ob Virus zugegeben. </li><li> Vorbereitenserielle Verdünnungen von der 20 mM Stammlösung. Die Konzentrationen sind in Abhängigkeit von der empirisch ermittelten Bereich von zu testenden Konzentrationen gewählt (wie in Tabelle 1 gezeigt). Bereiten Sie die Verdünnungen in Medien bei 10x die gewünschte endgültige Konzentration, dh wenn die endgültige Konzentration wird bis 100 um, machen Sie eine 1 mM Arbeits Lager. Anmerkung: Verbindungen mit IC 50 s über 5-10 um üblicherweise nicht gute Kandidaten für die Wirkstoffentwicklung. In den ersten Tests prüfen wir die Verbindungen nur gegen den WT-Vektor. Vielversprechende Verbindungen, die effektiv hemmen die WT-Vektor werden dann gegen eine Auswahl von resistenten Mutanten getestet. </li><li> Entfernen der 96-Well-Platten aus dem Inkubator und fügen die serielle Verdünnungen der zu den Vertiefungen in dreifacher Ausführung getestet werden Verbindungen (wie in Fig. 1, Schritt 2 gezeigt). Hinweis: Der in die Vertiefung gegeben Volumen sollte 1/10 Volumen Endkonzentration sein. So fügen Sie 22 &amp;mgr; l / (Endvolumen pOST-Virus zusätzlich 220 ul) für die Infektiosität Assays. Für Zytotoxizitätsassays, fügen Sie 11 ul / (Endvolumen 110 ul / Vertiefung). </li><li> Geben die 96-Well-Platten in den Inkubator. Für eine zelluläre Zytotoxizität Bildschirm, brüten die 96-Well-Platten 48 h bei 37 ° C und keine weiteren Manipulationen werden in Protokoll Nr. 4 benötigt: gehen Sie zu Protokoll 5 Für Infektiosität Assays, folgen weiter den Anweisungen in Protokoll Nr. 4.. </li><li> Nur Infektiosität Assays. Entfernen der Platten aus dem Inkubator nach einem Minimum von 3 h Inkubation bei 37 ° C mit den Verbindungen zu analysieren. Anmerkung: Dies ermöglicht die Verbindung von den Zellen vor der Infektion mit dem HIV-Vektor aufgenommen werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung der Lager-Virus 33, 34 (in der Regel ca. 01.03 Uhr), die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2-1,5 relativen Luciferase-Einheiten (RLE) in unbehandelten Zellen produzieren wird. Eine ganze Platte wird ca. 10 ml Verdünnung nehmented-Virus. Füge 100 &amp;mgr; l Virus zu jeder der Vertiefungen, unter Verwendung von entweder 8 oder 12 Mehrkanalpipette. Sie Virus zu den negativen / Hintergrund-Kontrollvertiefungen nicht hinzu. Rückgabe der Platten an den 37 ° C-Inkubator für 48 Stunden. Hinweis: 1:3 Lager Verdünnung des Virus ist typisch Verdünnung, die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2 -1,5 RLUs basierend auf einer p24-Test zeigt, dass die Viruskonzentration im Überstand beträgt ca. 500 ng in 1,0 ml produzieren wird. </li></ol> 5. Vorbereitung und Messung der Zytotoxizität und Infektiosität in 96-Well-Platten <ol><li> Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen (Phenolrot in den Medien mit der Luciferase-Signal stören). Verwenden Sie eine Glaspipette mit einer 200 ul Pipettenspitze bis zum Ende befestigt. Start an der Spitze der Medien und langsam arbeiten nach unten in Richtung der unteren Ecke des Brunnens. Zu viel Zeit verbringen Sie am unteren Rand des Brunnens, oder Zellen können aus dem Bohrloch entfernt werden. </li><li> 100 l PBS, ergänzt mit 0,5 mM MgCl 2 in jede Vertiefung. Dies muss unmittelbar erfolgen, nachdem das Medium entfernt, so dass die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Nur für Zytotoxizitätsassays, 5 ml Substratpuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest zu jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen für eine 96-Well-Platte aus. <ol><li> In 50 ul Zelllysepuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest in jede Vertiefung. Schütteln der Platte mit 96 Vertiefungen bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. </li><li> In 50 ul des rekonstituierten ATP Lumineszenz-Nachweis-Assay-Reagenz in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrolle / Hintergrund-Brunnen. Schütteln bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. Die Platten bei RT für 20 Minuten inkubieren, um Zeit für Signalentwicklung zu ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit dem Mikroplatten-Luminometer. Hinweis: Öffnen Sie die SoftMax Pro Mikroplatten-Luminometer Programm. Stellen Sie sicher, das Luminometer Lumi ist zu messenzenz bei einer Empfindlichkeit von 5 Messwerten / gut. </li></ol></li><li> Nur für die Infektiosität Assays, 10 ml Substratpuffer von der Lumineszenz Reporter-Gen-Assay auf jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen ist ausreichend für jede Platte mit 96 Vertiefungen. <ol><li> 100 l rekonstituiert Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz in jede Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um Zeit für Signalentwicklung ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometer, wie in Abschnitt 5.3.3 durchgeführt. </li></ol></li></ol> 6. Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte für die Verbindungen <ol><li> Übertragen Sie die Daten aus der Luciferase-Mikroplatten-Luminometer in eine Excel-Tabelle. <ol><li> Durchschnittliche sowohl die Luciferase Daten in dreifacher Ausfertigung und Hintergrund / Steuerdaten. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hinter / Steuersignal von der dreifachen durchschnittlichen Signal für den gesamten Konzentrationsbereich. </li> &lt;li&gt; normalisieren die Hintergrund korrigierten mittleren Signal für die Konzentrationsbereiche gegen die Aktivität, ob es sich um Zytotoxizität oder Infektiosität in Abwesenheit irgendeiner Verbindung, um die prozentuale Inhibierung zu bestimmen. Hinweis: prozentuale Hemmung wird als die Luciferase-Aktivität in Anwesenheit von Arzneimittel in der Abwesenheit von Arzneimittel, multipliziert mit 100 geteilt durch die Luciferase-Aktivität bestimmt. </li></ol></li><li> Verwenden Kaleidagraph Software-Programm zu CC 50 und IC 50-Werte zu erhalten <ol><li> Übertragen Sie sowohl die empirisch ermittelten Konzentrationsbereich und prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph. </li><li> Zeichnen Sie die Daten mit dem Konzentrationsbereich auf der x-Achse und die prozentuale Inhibierung der Luciferase-Aktivität auf der y-Achse. </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben eine schnelle, effiziente und reproduzierbare Assay zum Screening von Verbindungen, die für die Zytotoxizität und auf ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und arzneimittelresistenten HIV-1 hemmen, verwendet werden können. Die Fähigkeit, schnell Verbindungen zu identifizieren und prüfen ihre Wirksamkeit und Zytotoxizität bei der Entwicklung von neuen und verbesserten Arzneimitteln gegen HIV-1 wichtig. Sobald Bleiverbindungen identifiziert werden, können Analoga der Bleiverbindung hergestellt werden und unter Verwendung des gleichen Assays. Der Test ist relativ einfach. Es gibt sowohl positive und negative Kontrollen, die dem Benutzer die häufigsten Probleme (toxische Verbindungen, Probleme mit dem Vektor stock) Diagnose zu ermöglichen. Die Verwendung eines Dreifachsatzes von Vertiefungen ohne zugesetzte Verbindung zeigt, dass die Virusinfektion aufgetreten. Die Tatsache, dass die Cytotoxizität in einem unabhängigen Test gemessen vermeidet Fehlinterpretation einer Verringerung der Luciferase von Zytotoxizität als eine spezifische Wirkung auf die virale Replikation verursacht werden. Die kritischen Schrittein dem Protokoll werden die Platten vorbereitet, so dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind, daß die Bohrungen über die entsprechenden Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen, indem die gleiche Menge an Virus zu jeder der Vertiefungen, und die Messung der Luciferase-Aktivität Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte. Der Test ist sicher, quantitative und reproduzierbar. Der Test ist sicher, weil der Vektor-Replikation defekt. Der Test ist quantitativ und reproduzierbar, da sie auf einer einzigen Runde Vektor, der Luciferase exprimiert, die genau und bequem untersucht werden kann, nach. In einer mehrjährig Virusreplikation Assay wird die gemessene IC 50 hängt von der Anzahl der viralen Lebenszyklen; dies ist ein besonderes Problem, wenn die Tests umfassen sowohl WT und resistenten Viren, die deutlich unterschiedliche Replikations Kapazitäten haben können. Es wurden mehrere enzymatische Tests zuvor berichtet, dassverwendet werden, um an Inhibitoren screenen. Assays, die Echtzeit-PCR-Technologie beinhalten, um integrierte DNA messen erfordern gereinigt rekombinante Proteine ​​(e) und sind in der Regel sowohl arbeitsintensiv und teuer 36, 37. Obwohl es möglich ist, die enzymatische Assays verwenden, um die Wirkung der Verbindungen auf die andere virale Enzyme (RT und Protease) zu messen, wobei jedes Enzym erfordert eine eigene Testsystem. Die eine Runde Vektor-Assay wie beschrieben, kann verwendet werden, ohne Änderung an für RT-Inhibitoren zu screenen. Ein ähnlicher Test kann verwendet werden, um Protease-Inhibitoren zu screenen; jedoch in einem Protease-Inhibitor-Assay, die Verbindungen müssen auf die die Vektoren verwendet Zellen hinzugefügt werden. Eine verwandte Assay mit verschiedenen Zellen und Vektoren können auch verwendet werden, um Umschlag (env) und das Eindringen von HIV-Fusionsinhibitoren screenen. Schließlich kann der Assay verwendet werden, in einem größeren Maßstab, mit automatisierten Roboterspendern. So kann der Assay verwendet werden, um große Bibliotheken von Verbindungen gegen WT und m screenenutant HIV. Die Tatsache jedoch, kann der Assay einen Inhibitor der HIV-Replikation, die in verschiedenen Stadien des viralen Lebenszyklus weist auf eine Beschränkung in der Interpretation der Daten wirkt, zu erfassen. Von selbst der Test wird nicht definiert, welcher Schritt im Lebenszyklus durch eine Verbindung blockiert. Wenn diese Frage stellt, kann es durch Verwendung der Zeit des Assays zusätzlich 38 gelöst werden, und durch Testen der Verbindung gegen gereinigten rekombinanten viralen Proteinen. Leider trotz des Erfolgs der Anti-HIV-Arzneimittel, gibt es immer noch Probleme mit sowohl Beständigkeit und Toxizität. In Abwesenheit einer wirksamen Anti-HIV-Impfstoff, ist es notwendig, nicht nur neue therapeutische Arzneimittel, die wirksam sein werden anhand der vorhandenen Arzneimittel-resistenten Mutanten, sondern auch zu prophylaktischen Medikamente, die die Ausbreitung des Virus zu reduzieren entwickeln zu entwickeln. Wenn die prophylaktische Anwendung von Anti-HIV-Medikamente incudes die Behandlung von nicht-infizierten Menschen wird dieser Ansatz eine besondere Belastung für die Entwicklung von Medikamenten, haben l sind platzierenittle oder keine langfristige Toxizität.

Die Verfügbarkeit von Medikamenten, die an einige wesentliche Schritte in der HIV-1 viralen Lebenszyklus zu Kombinationstherapie (so genannte hochaktive antiretrovirale Therapie oder HAART), die sich stark verbessert hat die Behandlung von HIV-1-Infektionen, und die langfristige Überlebensrate geführt der Patienten. HAART, die typischerweise verwendet Kombinationen von zwei Nukleosid-Reverse-Transkriptase-(RT)-Hemmer und entweder ein Protease-Inhibitor oder ein Nicht-Nukleosid-RT-Hemmer, wurde jetzt eine tödliche Krankheit umgewandelt in ein Leben lang Zustand 1-5. Trotz der vielen Erfolge von HAART in verzögerter Unterdrückung der Virusreplikation, hat es jedoch Einschränkungen. HAART nicht auszurotten HIV, so dass die Patienten nicht geheilt und Therapie ist das Leben lang. Es gibt Probleme mit Medikamententoxizität und mit der Entstehung von resistenten Sorten. Widerstand kann auf alle zugelassenen Anti-HIV-Medikamente, einschließlich der neu zugelassenen Medikamente, die HIV-Integrase (IN) Ziel kommen. Arzneimittelresistenz entsteht wahrscheinlich becaVerwendung von spontanen Mutationen, die während der viralen Replikation (Fehlerrate von 3 x 10 -5 Mutationen / base / Replikationszyklus) auftreten 6. Wenn Mutationen entstehen in den Genen, die für die Ziele der Anti retrovirale Medikamente codiert, wird eine kleine Teilmenge dieser Mutationen zu einer Verringerung der Empfindlichkeit des Virusstammes, um die Medikamente führen. Um die Entwicklung von Resistenzen zu vermeiden, muss Wirkstoffkonzentrationen auf einem Niveau, das die HIV-Replikation vollständig zu unterdrücken, aufrecht erhalten werden. Schlechte Einhaltung der Therapieregime verschärft das Problem, und kann auf die schnelle Entwicklung von Resistenzen führen 7-9. Obwohl Wirkstoffkonzentrationen bei Patienten aufgrund unterschiedlicher Resorption, Stoffwechsel, Verteilung und Ausscheidung Ebenen variieren können hohe Wirkstoffkonzentrationen, um die Toxizität 10 führen. Seit Therapie weiterhin für das Leben des Patienten, gibt es ernsthafte Sicherheitsbedenken hinsichtlich der langfristigen Toxizität von Antiretroviren. Die antiretrovirale Medikamente häufig in HAART verwendet werden, können negative Auswirkungen haben einnd gab es Fälle, wo die Nebenwirkungen wurden lebensbedrohlich 11-15. Die Probleme, die Patienten stoßen mit der Entwicklung von Widerstand und Toxizität zugrunde liegen, die Notwendigkeit, neue Medikamente, die die Replikation der gemeinsamen resistenten Stämme des Virus mit wenig oder keine langfristige Toxizität effektiv blockieren zu entwickeln. Somit besteht ein Bedarf an einem Assay, der für die Verbindungen, die wesentlichen Schritte schnell blockieren im viralen Lebenszyklus zu screenen kann. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um die Zytotoxizität der Verbindungen A und ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und Arzneimittel-resistente HIV-Stämme schnell und effizient zu blockieren auszuwerten. Der Test wir verwenden, ist ähnlich zu einem Test, der entwickelt wurde, um für eine Arzneimittelresistenz in Virus aus Patienten isoliert 16-18 screenen. Obwohl der Test kann ohne Modifikation zum Screening auf Verbindungen, die HIV reverse Transkription blockieren kann verwendet werden, werden wir describe mit dem Test zu bewerten, IN-Inhibitoren. IN ist ein essentielles virales Enzym, das die virale DNA in das zelluläre Genom 19 einfügt. Obwohl eine Reihe von vielversprechenden IN Inhibitoren entwickelt werden, von denen einige derzeit in klinischen Studien nur Isentress 20, 21 (auch als Raltegravir oder RAL bekannt) und in jüngerer Zeit, Elvitegravir (EVG) 22 und Dolutegravir (DTG) 23 wurden von der FDA zugelassen. Diese Verbindungen sind sowohl gegen HIV-B-B-Subtypen und nicht in Zellkultur und in Patienten 24, 25 aktiv. Die Behandlung mit RAL wählt für Arzneimittel-resistente HIV-1-IN-Mutanten, einschließlich Y143R, N155H und G140S/Q148H 24, 26-31. N155H G140S/Q148H und reduzieren auch die Wirksamkeit von EVG, die die Notwendigkeit, IN Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs), die wirksam gegen diese Resistenz-Mutationen sind Design und Entwicklung der zweiten Generation betont.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA Filter Unit, 0.45 &amp;micro;M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&amp;Delta;Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Obwohl eine Reihe von Anti-HIV-Arzneimittel genehmigt wurden, gibt es immer noch Probleme mit der Toxizität und Medikamentenresistenz. Dies zeigt die Notwendigkeit, neue Verbindungen, die Infektion durch die gemeinsame arzneimittelresistenten HIV-1-Stämme mit minimaler Toxizität hemmen kann, zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um schnell zu bestimmen, die zelluläre Zytotoxizität und Wirksamkeit einer Verbindung gegen WT und Mutanten-Virusstämme. Die gewünschte Zielzelllinie wird in 96-Well-Platte ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation werden seriell Verdünnungen der zu testenden Verbindungen zugegeben. Keine weitere Manipulationen sind für zelluläre Zytotoxizität-Tests erforderlich; für Anti-HIV-Tests eine vorbestimmte Menge von entweder einer WT oder arzneimittelresistenten HIV-1-Vektor, der Luciferase zu den Zellen gegeben drückt. Zytotoxizität wird unter Verwendung eines ATP-abhängige Lumineszenz-Assay und die Wirkung der Verbindungen auf die Infektiosität gemessen wird durch Bestimmen der Menge des gemessenen luciferase in Gegenwart oder Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitoren. Diese Screening-Test dauert 4 Tage dauern und mehrere Verbindungen parallel untersucht werden. Verbindungen werden dreifach durchmustert, und die Daten sind auf die Infektiosität / ATP-Spiegel in Abwesenheit von Zielverbindungen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und genaue Messung der Wirksamkeit und Toxizität von potentiellen Anti-HIV-Verbindungen.

Wenn der Test (Fig. 1, Schritte 1 und 2) wurde erfolgreich durchgeführt, dann sollte die Luciferase-Werte, die in Tabelle 2 präsentierten Daten ähneln Scannen über den Konzentrationsbereich. eine potenziell starke Verbindung wird zeigen zunehmende Luciferase-Aktivität von links nach rechts, und die Steuerung sollte die höchste Luciferase-Aktivität zu haben. Wenn die Luciferase-Aktivität hat 0,1 Relative Luciferase-Einheiten (RLE) über den Konzentrationsbereich nicht überschreiten, dies in der Regel an, dass die Verbindung der Zellen getötet. Wenn die Luciferase Daten größer als oder gleich 2,0 RLU für alle Serienverdünnungen, dann wurden die Verbindungen nicht in der Lage, HIV-1-Infektionen bei den getesteten Konzentrationen zu inhibieren. Auftragen der Konzentration der Verbindungen im Vergleich zu der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph (Tabelle 3, Teil A), nach dem Durchführen einer linearen Regressionsanalyse, werden ähnliche Ergebnisse zu produzieren t<html> Schlauch in Tabelle 3, Teil B gezeigt <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Vorbereitung der HIV-1-Virus-Stocks und dem Aufbau der zelluläre Zytotoxizität und Single-Runde Infektiosität Assays. In Schritt 1 293T-Zellen mit pNL4.3ΔEnv.LUC und VSV-G transfiziert und für 48 Stunden inkubiert, um die Virus-34 produzieren . Das Virus wird geerntet und gelagert (bei -80 ° C in Aliquots eingefroren), bis er in die Infektiosität-Assays verwendet wird. Für Schritt 2 werden HOS-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und 24 h lang inkubiert. Die Zellen werden dann mit seriellen Verdünnungen der für 3 Stunden getestet werden Verbindungen vorinkubiert und dann mit Virus (entweder WT oder resistenten) infiziert. Nach einer 48-stündigen Inkubation wird die Luciferase-Aktivität gemessen. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabelle 1. Drug Screening Verdünnungs Prototype. Eine strengere Screening beinhaltet 11 Verdünnungsreihen, die in der Regel beginnen bei 10 uM und endet um 0,0005 uM. Die serielle Verdünnungen vorbereitet 10x; es gibt 100 ul Zellen und 100 &amp;mgr; l Virus pro Vertiefung). In diesem Volumen und nach diesen Berechnungen werden die seriellen Verdünnungen genug für 3 Zeilen eines gesamten 96-Well-Platte sein. Die Zytotoxizität-Tests werden auf ähnliche Weise hergestellt; aber die 11 serielle Verdünnungen beginnen bei 250 uM und am Ende bei 0,05 uM. Nur 11 ul der Verdünnungen werden in die Vertiefungen in der Platte, die 100 ul Zellen enthalten aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabelle 2. Luciferase-Signal Datenauslesung und Bestimmung der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität. Die Datentabelle zeigt einen typischen Satz von Luciferase-Daten für eine erfolgreiche Verbindung. Die Tabelle zeigt auch die weiteren Berechnungen erforderlich, um die prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität und die CC-50 und IC 50-Werte zu bestimmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabelle 3. Lineare Regressionsanalyse Datentabelle. Teil A. Grafische Darstellung der Konzentrationsbereich gegenüber der prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph verwendet wird die entsprechenden Hemmkurven zu produzieren. Teil B, Die Hemmung Kurven durch die parametrische 3 definiertsigmoidale Funktion und Passform auf den Daten, die von linearen Regressionsanalysen 18. Diese Daten-Tabelle wird dann in Verbindung mit Microsoft Excel verwendet, um die Wirkstoffkonzentrationen erforderlich, um Virus-Integration und zelluläre Zytotoxizität von 50%, zB IC 50 und CC 50 hemmen berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Aufrufe.  National Cancer Institute.  Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1. 

Serie: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Forschung

Genetik

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Immunologie und Infektion

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Medizin

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...