この研究は、NCIの学内研究プログラムによってサポートされていました。

マスター株式の1。準備<ol><li> DMSO中でテストされる化合物のマスターストックを作る。 20 mMの標準濃度で在庫を準備します。 注：10mMの上記の任意の濃度を用いることができる。このアッセイを確認するための陽性対照として使用することができる化合物は、RAL、EVGおよびDTGが挙げられる。 </li><li>確保化合物は、15秒間溶液を複数回ボルテックスし、室温で1時間インキュベートすることによりDMSOに溶解する。使用するまで-20℃の暗所で20 mMのストック溶液を保管してください。 </li></ol>化合物スクリーニングのための96ウェルプレートの2。準備<ol><li>試験される細胞株（ 例えば、HOS又はTZM-blを）を選択し、（培地中で（4,000細胞/ウェル）を4×10 4細胞/ mlの密度でそれらの細胞を100μlのシード例えば、ダルベッコ改変イーグル又はDMEM培地5％（v / v）のウシ胎児血清、5％新生仔ウシ血清、ペニシリン（50単位/ ml）を補充したプラスストレプトomycin）。 </li></ol>ウイルスストックの3。​​生成 （ 図1に示すように、ステップ1）、32-34、293細胞をトランスフェクトすることにより、VSV-G偽型HIVを産生する。 <ol><li>トランスフェクションの前の日に、1.5×10 6細胞の密度で直径100mmの皿上にプレートした293細胞。 </li><li>リン酸カルシウム法35を使用し、VSV（pHCMV-G）の4μgの-トランスフェクションの日に、野生型または変異型のHIV（ΔLUCpNLNgoMIVR）の16μgの293細胞をトランスフェクト。 </li><li>約リン酸カルシウム沈殿後6時間が追加され、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回、293細胞を洗浄し、48時間新鮮な培地でインキュベートする。 [DMEM、5％（v / v）のウシ胎児血清、5％新生仔ウシ血清、およびペニシリン（50単位/ ml）およびストレプトマイシン（50μg/ ml）を補充した]。 </li><li>直径100mmから培地を除去して、上清を含有するウイルスを回収する皿、RTで30分間ターボDNaseで上清を治療し、感染アッセイにおいて調製に培地中の上清を希釈、45μmの孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタ処理、10分間3,000 rpmでの低速遠心分離により上清を明らかにする。 -80℃で、一定分量で、凍結したウイルス上清を保存する 注：上清中のp24の量は、HIV-1のp24酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて決定される。 p24の濃度は、試料中のウイルスの量を制御するために使用される。ウイルスの約500 ngの感染前の日に1.5×10 5細胞/皿の密度で直径60mmの皿上にプレートHOS細胞に添加される。インキュベーションの48時間後、細胞を収穫し、遠心分離により回収し、洗浄し、100μlのPBSに再懸濁した。発光レポーター遺伝子アッセイ試薬の等量を追加し、セクション5.4.1に記載したようにルシフェラーゼ活性を測定し5.4.2。ステップ4.6で説明したようにこのことから、ウイルスの適切な希釈を行うことができる。 </li></ol> 96ウェルプレートに4。物のスクリーニング三重に各化合物を選別し、結果を平均する。 注：ウイルス複製の各化合物の効果を、任意の化合物の非存在下で得られた複製のレベルに正規化することによって補正される。 <ol><li>スクリーニングされる経験的な濃度範囲を決定する。 注：典型的には、11連続希釈を有するスクリーンは、カラム7連続希釈によってプレート画面カラムに化合物を添加することにより製造される、行によって化合物を添加することにより製造される。井戸のセット一連の化合物なしの制御のために予約しておく必要があります。また、1列または1行には、負/バックグラウンドコントロールとして動作するように空白のままにする必要があります。ウイルスが追加された場合に最後に、それは細胞の細胞傷害性または感染性アッセイであるか否かを決定するであろう。 </li><li>準備する20 mM保存液から段階希釈​​。 （ 表1に示されるように）濃度が試験される濃度は経験的に決定された範囲に応じて選択される。最終濃度が100μMであることを行っている場合は、 すなわち 、1 mMのワーキングストックを作る、10倍の所望の最終濃度で培地中に希釈液を調製する。 注：50秒5〜10μM以上のICを有する化合物は通常、医薬品開発のための良い候補ではない。最初の検定では、唯一のWTベクターに対する化合物を試験する。効果的に、WTベクトルを阻害有望な化合物は、その後、薬剤耐性変異のパネルに対してテストされます。 </li><li>インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、三連のウェルに試験されるべき化合物の連続希釈物を加える（ 図1に示すように、ステップ2）。 注意：ウェルに加え、ボリュームは最終濃度の1/10の体積にする必要があります。このように、22μL/ウェル（最終容量Pを追加OSTウイルスのほかには、感染性アッセイのために220μL）です。細胞毒性アッセイのために、11μL/ウェルを（最終容量は110μL/ウェルである）を追加します。 </li><li>インキュベーターに96ウェルプレートを返す。性細胞傷害画面の場合は、37℃で96ウェルプレートを48時間インキュベートし、それ以上の操作はプロトコル4で必要とされていません。プロトコル5に進んで感染性アッセイのために、プロトコル4の指示に従って進んでください。 </li><li>感染性試験のみ。解析対象となる化合物を用いた37℃で3時間培養した後、最低インキュベーターからプレートを取り外します。 注：これは、化合物がHIVベクターで感染の前に細胞に取り込まれることを可能にする。 </li><li>ウイルス33のストック希釈液を調製、34（通常は約1:3）、未処理細胞で0.2から1.5の相対ルシフェラーゼ量（RLU）との間のルシフェラーゼシグナルを生成すること。プレート全体はDILU、約10ミリリットルがかかりますテッドウイルス。 8または12マルチチャンネルピペッターのいずれかを使用して、各ウェルに100μlのウイルスを追加します。ネガティブ/背景コントロールウェルにウイルスを追加しないでください。 48時間、37℃のインキュベーターにプレートを返します。 注意：ウイルスの1時03分株式の希釈上清中のウイルス濃度は1.0ミリリットル中に約500 NGであることを示すP24アッセイに基づく0.2 -1.5のRLUの間のルシフェラーゼシグナルを生成し、典型的な希釈である。 </li></ol> 5。準備と96ウェルプレートに細胞毒性と感染性の測定<ol><li>井戸から培地を吸引除去する（メディアにおけるフェノールレッド、ルシフェラーゼ信号に干渉することができます）。端に取り付けられた200μlのピペットチップでガラスピペットを使用してください。メディアのトップでスタートし、徐々に井戸の底の角に向かって働いています。井戸の底にあまりにも多くの時間を費やすことはありませんか、細胞がうまくから削除することができます。 </li><li> 100μlのPBSを追加する0.5メートルで補充各ウェルに、MのMgCl 2。これは、細胞が乾燥しないように培地を除去した直後に行われる必要がある。 </li><li>唯一の細胞毒性アッセイのために、供給凍結乾燥試薬の各バイアルに発光ATP検出アッセイから基板緩衝液5mlを加える。 Oneバイアルを96ウェルプレートに十分である。 <ol><li>発光ATP検出アッセイからの各ウェルに細胞溶解緩衝液50μlを追加します。コンパクトサーモミキサーを用いて室温で5分間700rpmで96ウェルプレートを振る。 </li><li>ネガティブコントロール/バックグラウンドウェルを除く全てのウェルに再構成された発光ATP検出アッセイ試薬50μlを加える。コンパクトサーモミキサーを用いて5分間室温で700 rpmで振とうする。信号展開のための時間を可能にするために20分間室温でプレートをインキュベートする。 </li><li>マイクロプレートルミノメーターを用いて、96ウェルプレートをお読みください。 注意：ソフトマックスプロマイクロプレートルミノメータープログラムを開きます。必ずルミノメーターがルミを測定するように設定されていることを確認5回/ウェルの感度でnescence。 </li></ol></li><li>唯一の感染性​​アッセイのために、供給凍結乾燥試薬の各バイアルに発光レポーター遺伝子アッセイから基質緩衝液10ミリリットルを追加。 Oneバイアルを各96ウェルプレートに十分である。 <ol><li>各ウェルに再構成された発光レポーター遺伝子アッセイ試薬を100μlを加える。信号展開のための時間を可能にするために20分間室温でインキュベートする。 </li><li>セクション5.3.3で実行されるようなマイクロプレートルミノメーターを用いて、96ウェルプレートをお読みください。 </li></ol></li></ol>化合物について、CC 50およびIC 50値の6。決定<ol><li> Excelスプレッドシートにマイクロプレートルミノメーターからのルシフェラーゼデータを転送します。 <ol><li>平均と背景の両方の三重/制御信号データ中のルシフェラーゼのデータ。全濃度範囲の平均三重の信号から平均バックグラウンド/制御信号を差し引く。 </li> &lt;李は&gt;背景は、それが阻害パーセントを決定するために任意の化合物の非存在下で、細胞毒性または感染性であるかどうか、活動に対する濃度範囲の平均信号を補正する標準化する。 注：パーセント阻害は、100を乗じた薬物の非存在下でのルシフェラーゼ活性で割った薬剤の存在下でのルシフェラーゼ活性として定義される。 </li></ol></li><li> CC 50およびIC 50値を得るためにKaleidagraphのソフトウェアプログラムを使用し<ol><li>経験的に決定された濃度範囲およびカレイダグラフにルシフェラーゼ活性の阻害率の両方を転送します。 </li><li> x軸とy軸上のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント上の濃度範囲でデータをプロット。 </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、細胞毒性およびWTおよび薬剤耐性HIV-1の両方の複製を阻害する能力について化合物をスクリーニングするために使用することができ、迅速、効率的、かつ再現可能なアッセイを記載している。迅速な化合物を同定し、それらの有効性及び細胞毒性を試験する能力は、HIV-1に対する新規かつ改良された薬物の開発に重要である。リード化合物が同定されると、リード化合物の類似体が生成され、同じアッセイを用いて試験することができる。このアッセイは、比較的簡単である。ユーザーは最も一般的な問題（毒性化合物、ベクターストックに関する問題）を診断することを可能に正と負の両方のコントロールがあります。添加していない化合物を三連のウェルのセットの使用は、ウイルス感染が発生したことを示している。細胞毒性は独立したアッセイで測定されているという事実は、ウイルス複製の特定の効果として、細胞毒性に起因するルシフェラーゼの減少を誤解避けることができます。 重要なステップ細胞が均一にウェルのそれぞれに同じ量のウイルスを加え、にルシフェラーゼ活性を測定し、ウェルを試験されるべき化合物の適切な濃度を有することを、ウェル中に分配されるようにプロトコルでプレートを準備しているCC 50およびIC 50値を決定します。 アッセイは、安全で、定量的、かつ再現性がある。ベクターが複製欠陥があるので、このアッセイは安全です。それが正確かつ簡便にアッセイすることができるルシフェラーゼを発現する単一ラウンドベクターに基づいているので、このアッセイは、定量的および再現可能である。マルチラウンドのウイルス複製アッセイにおいて、測定されたIC 50は、ウイルスのライフサイクルの数に依存する;アッセイは、WTと有意に異なる複製能力を有することができる薬剤耐性ウイルスの両方を含むとき、これは特に問題である。 いくつかの酵素アッセイはそれができ、以前にも報告されているIN阻害剤をスクリーニングするために使用される。統合されたDNAを測定するために、リアルタイムPCR技術を伴うアッセイは、より労働集約的であり、36、37高価で、精製された組換えタンパク質（複数可）を必要とし、一般的である。それは、他のウイルス酵素（RTおよびプロテアーゼ）に対する化合物の影響を測定する酵素アッセイを使用することが可能であるが、各酵素は、独自のアッセイシステムを必要とする。一周ベクターアッセイは、記載されるように、RT阻害剤をスクリーニングするために、修正することなく、使用することができる。同様のアッセイは、プロテアーゼインヒビターをスクリーニングするために使用することができる;しかしながら、プロテアーゼ阻害アッセイにおいて、化合物は、ベクターを製造するために使用される細胞に添加されなければならない。関連アッセイは、異なる細胞およびベクターを用いて、エンベロープ（ENV）及びHIV侵入融合阻害剤をスクリーニングするために使用することができる。最後に、このアッセイは、自動化されたロボットのディスペンサーで、大規模に使用することができる。従って、アッセイは、WTおよびmに対する化合物の大きなライブラリーをスクリーニングするために使用することができるutant HIV。しかしながら、実際のアッセイでは、データの解釈に制限はウイルスのライフサイクルポイントの異なる段階で作用するHIV複製の阻害剤を検出することができる。単体でアッセイは、ライフサイクルのステップは化合物によりブロックされているかを定義していません。この疑問が生じた場合には、添加アッセイの38時間を使用することによって解決され、精製された組換えウイルスタンパク質に対して化合物を試験することにより得ることができる。 残念ながら、抗HIV薬の成功にもかかわらず、抵抗および毒性の両方に問題が残っています。有効な抗HIVワクチンの非存在下で、既存の薬物耐性変異体に対して有効であるだけでなく、ウイルスの拡散を低減することができる予防的な薬剤を開発するための新しい治療薬を開発するだけでなく、必要とされている。抗HIV薬の予防的使用は、感染していない人々の治療をincusの複数形の場合、このアプローチはリットルを有する薬物の開発に特別な負担を配置するittleあるいは全く長期の毒性。

HIV-1ウイルスの生活環のいくつかの重要なステップを標的とする薬物の利用可能性が大幅にHIV-1感染の治療、および長期生存を改善した（高活性抗レトロウイルス療法、またはHAARTと呼ばれる）併用薬物療法につながっている患者の。典型的には2つのヌクレオシド系逆転写酵素（RT）阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシドRT阻害剤のいずれかの組み合わせを使用してHAARTは、現在、生涯条件1-5に致命的な疾患を変換した。しかし、ウイルス複製の持続抑制におけるHAARTの多くの成功にもかかわらず、それには限界がある。 HAARTは、HIVを根絶しないため、患者は治癒しないと治療が人生長いです。薬物毒性を持つと薬剤耐性株の出現には問題がある。抵抗は、HIVインテグラーゼ（IN）を対象に新たに承認された薬を含む承認された抗HIV薬、のすべてに発生する可能性があります。薬剤耐性はおそらくBECAを生じウイルス複製（3×10 -5の変異/塩基/複製サイクルの誤り率）6中に生じる自然突然変異の使用。変異が抗レトロウイルス薬のターゲットをコードする遺伝子で発生した場合、これらの変異の小さなサブセットは、薬剤へのウイルス株の感受性の減少につながる。薬剤耐性の発生を回避するために、薬物濃度は、完全にHIVの複製を抑制するレベルに維持されなければならない。治療計画への密着不良が問題を悪化させ、抵抗7-9の急速な発展につながることができます。薬物濃度が原因で、異なる吸収、代謝、分布、および排泄レベルに患者で異なりますが、高い薬物濃度は、毒性が10につながることができます。治療は、患者の生活のために続けているため、抗レトロウイルスの長期毒性について深刻な安全上の懸念がある。一般にHAARTで使用される抗レトロウイルスが有害作用を有することができるND副作用は人生は11から15を脅かしてきた発生率があった。患者が抵抗性と毒性の開発で発生する問題を効果的にほとんど、あるいは全くの長期的な毒性を持つウイルスの一般的な薬剤耐性株の複製を阻止する新薬を開発する必要性の根底にある。 これにより、迅速にウイルスの生活環に必須の手順を遮断する化合物をスクリーニングすることができるアッセイが必要とされている。ここでは、化合物および迅速かつ効率的にWTおよび薬剤耐性HIV株の両方の複製をブロックする能力の細胞毒性を評価するために使用することができる効率的なアッセイを記載している。我々が使用するアッセイは、患者16〜18から分離されたウイルスに薬剤耐性をスクリーニングするために開発されたアッセイに似ています。 アッセイは、HIV逆転写を遮断することができる化合物をスクリーニングするために改変することなく使用することができるが、我々はDESCRうIBE阻害IN評価するアッセイを使用して。 INは、細胞ゲノムへのウイルスDNA 19を挿入必須ウイルス酵素である。阻害剤で有望なの数が開発されていますが、そのうちのいくつかは現在、アイセントレス20、21（これもラルテグラビルやRALとも呼ばれます）の臨床試験を受けているし、最近では、Elvitegravirは（EVG）22とDolutegravir（DTG）23があったFDAが承認した。これらの化合物は、25 HIVおよびB細胞培養物中の患者24における非Bサブタイプの両方に対して活性である。ただし、RALを用いた治療は、薬剤耐性HIV-1変異体では、Y143R、N155H、およびG140S/Q148H 24、26〜31を含むために選択されます。 N155HとG140S/Q1​​48Hはまた、これらの耐性変異に対して有効である鎖転移阻害剤（INSTIs）の第二世代を設計し、開発する必要性を強調しているEVGの有効性を減少させる。

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA Filter Unit, 0.45 &amp;micro;M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&amp;Delta;Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

抗HIV薬の番号が承認されているが、毒性および薬剤耐性の問題が依然として存在する。これは、最小限の毒性で共通の薬剤耐性HIV-1株による感染を阻害することができる新しい化合物を同定する必要性を示している。ここでは、急速にWT及び突然変異体ウイルス株に対する化合物の細胞傷害性および有効性を決定するために使用できる効率的なアッセイを記載している。 所望の標的細胞株を96ウェルプレートに播種され、24時間のインキュベーション後、試験すべき化合物の逐次希釈液を添加する。これ以上の操作は、細胞性細胞傷害アッセイのために必要ありません。抗HIVために、ルシフェラーゼを発現するWTまたは薬物耐性HIV-1ベクターを細胞に添加されるか、所定量のアッセイ。細胞毒性は、ATP依存ルミネッセンスアッセイを用いて測定され、感染性に対する化合物の影響はlucifeの量を決定することによって測定される存在または推定阻害剤の非存在下で、RASE。 このスクリーニングアッセイの完了には4日かかり、多数の化合物を並行してスクリーニングすることができる。化合物は三連でスクリーニングされ、データは、標的化合物の非存在下での感染力/ ATPレベルに対して正規化される。この技術は、潜在的な抗HIV化合物の有効性および毒性の迅速かつ正確な測定を提供する。

アッセイ（ 図1、ステップ1と2）が正常に実行された場合、ルシフェラーゼ値を表2に示したデータ似る必要な濃度範囲にわたってスキャンし;潜在的に強力な化合物は、左から右にルシフェラーゼ活性を増加させることが明らかになり、制御が最も高いルシフェラーゼ活性を有するべきである。ルシフェラーゼ活性は、濃度範囲にわたって0.1相対ルシフェラーゼ単位（RLU値）を超えない場合、これは通常、化合物は細胞を死滅させていることを示している。ルシフェラーゼデータは以上全ての連続希釈を横切る2.0のRLUに等しい場合、化合物は、試験した濃度でHIV-1感染を阻害することができなかった。 カレイダグラフ（ 表3、パートA）中のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント対化合物の濃度をプロットし、線形回帰分析を実行した後、トンのに同様の結果を生成する<html> 表3に示すホース、パートB. <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> 図1 HIV-1ウイルスストックおよび細胞傷害性およびシングルラウンド感染性アッセイのセットアップの調製ステップ1で、293T細胞がpNL4.3ΔEnv.LUCとVSV-Gでトランスフェクトするとウイルス34を生成するために48時間培養。それは感染性アッセイで使用されるまでウイルス（アリコートで-80℃で凍結）を採取し、格納されている。ステップ2では、HOS細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートした。次いで、細胞を3時間試験されるべき化合物の連続希釈物と共にプレインキュベートし、次いでウイルス（WTまたは薬剤耐性のいずれか）に感染している。 48時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼ活性を測定する。 le1.jpg &quot;幅=&quot; 300 &quot;/&gt; 表1。シリアル希釈プロトタイプをスクリーニング医薬品。より厳格なスクリーニングは、通常10μMで開始し、0.0005μMで終了11段階希釈を必要とする。連続希釈10倍を用意している。細胞100μl、各ウェル中のウイルスの100μL）があります。このボリュームで、これらの計算に続いて、段階希釈は、全体の96ウェルプレートの3行には十分でしょう。細胞毒性アッセイは、同様に調製される;しかし11段階希釈は、250μMで開始し、0.05μMで終了。希釈液のわずか11μLの細胞100μlを含んでいるプレートのウェルに添加されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="表2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; 表2。ルシフェラーゼ信号データの読み出し、ルシフェラーゼ活性の阻害率の決定。データテーブルは、成功した化合物について、ルシフェラーゼのデータの代表的なセットを示しています。表には、ルシフェラーゼ活性の阻害率とCC 50およびIC 50値を決定するために必要な追加の計算を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="表3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> 表3。線形回帰分析データ表 。パートA。カレイダグラフにおけるルシフェラーゼ活性の阻害パーセントに対して使用される濃度範囲をグラフ化すると、適切な阻害曲線を生成する。パートBは 、阻害曲線をパラメトリック3によって定義されるシグモイド関数と線形回帰によってデータへのフィットが18を分析します。このデータテーブルは、その後、 例えば IC 50およびCC 50を 50％のウイルスの統合と細胞傷害性を阻害するのに必要な薬物濃度を計算するためには、Microsoft Excelと組み合わせて使用します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K ビュー.  National Cancer Institute. ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。 

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

遺伝学

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

免疫・感染学

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

医学

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

要約

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双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

の測定

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

要約

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双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

の測定

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製