Doy las gracias a las siguientes personas por su ayuda en el desarrollo de este protocolo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, y Mays Imad. Datos de espectrometría de masas y proteómica fueron adquiridas por el Consorcio de Proteómica de Arizona con el apoyo de NIEHS subvención ES06694 al SWEHSC, NIH / NCI subvención CA023074 al AZCC y por el Instituto BIO5 de la Universidad de Arizona. La financiación de este trabajo fue proporcionado por los Institutos Nacionales de la Salud (Instituto Nacional de Medicina General) de las subvenciones 1F32GM83661-01 y 1R15GM097714-01 a Jessica E. Garb.

1. Preparación del aparato electro-estimulador <ol><li> Conecte el cable de alimentación electro-estimulador a la salida y adjuntar pedal externo para la entrada de señal externa. Nota: Los cables eléctricos deben estar aislados correctamente y metal expuesto actual entrega no se deben tocar. Use guantes de látex o nitrilo para la protección. Interruptor de energía electro-estimulador debe estar en la posición OFF al conectar el cable de alimentación y fijar los cables. </li><li> Conecte el electrodo positivo al terminal de salida de rojo en electro-estimulador (cuando el interruptor de polaridad está en modo normal) y conectar el electrodo negativo al terminal de salida negro. Nota: Cada alambre electrodo debe terminar en una pinza. </li><li> Establecer estimulador para los siguientes ajustes iniciales recomendados: Tensión = 7 V, Frecuencia = 1 pulsos por segundo, retardo = 0 milisegundos, duración = 200 milisegundos, pulsos individuales cambian = regular, y el interruptor de modo = apagado. </li><li> Prueba de salida de electrodos adjuntando pinzas de cocodrilo a voltmeter cables de prueba positivos y negativos. Encienda el interruptor de alimentación estimulador y suministrar corriente con pedal de pie. </li></ol> 2. Preparación de inmovilizar fórceps y Otros Materiales <ol><li> Sumerja una punta de pinzas de peso pluma en revestimiento de plástico líquido y esperar cuatro horas para dejar secar recubrimiento. Envuelva bien 15 mm de la punta de la púa de oposición con una sola capa de hilo de coser de algodón, y asegurar el hilo de atar el extremo de un nudo. Nota: El hilo se utiliza para absorber una solución salina aplicada que promueve la conductividad eléctrica, mientras que el revestimiento de plástico proporciona aislamiento para retardar actual. </li><li> Cortar la punta de la aguja hipodérmica roma con tijeras afiladas y suavizar la apertura con papel de lija. Coloque la aguja a una trampa de residuos de vacío (por ejemplo, matraz de filtración al vacío) a través de la tubería. Nota: La aguja de distancia succionar agua y regurgitar, y servirá para completar el circuito creado por los electrodos del estimulador. El mu abertura de la agujast ser lo suficientemente pequeño para no perjudicar la araña, pero lo suficientemente grande como para solución de vacío sin la obstrucción (por ejemplo, 25 G x 1 ½ en calibre, ver Lista de Materiales). </li><li> Fórceps Posición de peso pluma horizontalmente en una posición bien cerrado utilizando una pinza de doble vertiente cubierto de vinilo asegurada a una base magnética o un aparato de soporte fijado en el campo de un microscopio de disección de vista, con plástico recubierto puntas de unas pinzas en la parte superior y el hilo recubiertos púa en la parte inferior. Nota: La abrazadera de dos puntas se mantiene en una posición estacionaria a la base magnética por un soporte de abrazadera (ver Lista de Materiales). Una banda de goma puede ser fijado firmemente alrededor puntas de las pinzas de peso pluma, al lado del soporte de pinzas, para añadir presión adicional para mantener las pinzas de peso pluma en una posición cerrada alrededor de la araña una vez introducido. </li><li> Adjuntar pinza electrodo positivo a punta inferior fórceps &#39;aguas arriba de la rosca y adjuntar pinza negativa a despuntar la aguja de vacío de metal. </li&gt; <li> Circuito de prueba actual con voltímetro colocando el cable positivo en fórceps púa entre hilo y pinza y colocar el cable negativo en la aguja de vacío embotado. Presione el pedal para asegurar que se detecte suficiente corriente y retire los cables si se detecta corriente suficiente. </li><li> Prepare varios tubos microcapilares para la recolección de veneno. Sostenga un solo tubo microcapilar en un extremo con una mano enguantada y en el otro extremo con una pinza de metal estériles, colocando el extremo fórceps en posición horizontal sobre una llama de mechero Bunsen. Tire del microcapillary con las pinzas de metal lejos de la llama para crear una punta alargada, mientras mantiene el otro extremo en una posición estacionaria. Nota: usar gafas de protección como microcapilares pueden fracturarse fácilmente. </li><li> Descanse microcapilares preparados en una tira de masilla de montaje en una placa de Petri. Examinar microcapillary termina bajo un microscopio de disección y crear un pequeño, la apertura biselada en el extremo desmenuzado con pinzas de metal esterilizados. </li><li> Label número variable de tubos estériles de 0,5 ml. Añadir agua desionizada estéril a tubos estériles (por ejemplo, 5 l de agua desionizada en autoclave). Cerrar los tubos y colocar tubos en el hielo. </li><li> Preparar la solución salina en un vaso de precipitados y llenar un segundo vaso de precipitados con agua tratada en autoclave. </li></ol> 3. Inmovilización de la araña en el fórceps <ol><li> A su vez en CO 2 tanque y transferir araña de plástico recoger vial cerrado (ver Lista de Materiales) en CO 2 cámara utilizando pinzas metálicas largas. Nota: las arañas viuda negra tienen veneno peligroso; Siempre use guantes durante este protocolo. </li><li> Mantenga araña en la cámara durante 5-10 minutos o hasta que anestesiado y ya no se mueve cuando pinchó suavemente con unas pinzas largas. Use la pipeta de transferencia para mojar hilo en pinzas con solución salina. Nota: Para obtener instrucciones sobre el CO 2 parámetros de anestesia para las viudas negras, consulte Spagna y Moore 19. </li><li> Recuperar araña anestesiado de CO 2cámara por recogerlo por sus patas anteriores utilizando pinzas de disección roma y las manos enguantadas. Mueva araña anestesiado a peso pluma aparato fórceps. Puntas separadas de fórceps de peso pluma cerrados y lugar cefalotórax de la araña en entre los dientes y permitir que los dientes se cierren cerrada para garantizar la araña se mantiene firmemente en su lugar, pero no está siendo aplastado. Asegúrese de que la araña se coloca lado dorso del caparazón hacia abajo (ver Foelix 20 de guía a la anatomía de la araña), que descansa sobre hilo recubierto de púa, y parte ventral del caparazón de cara al revestimiento de plástico, mientras que el electrodo positivo permanece unido a la punta inferior. Trabaje con rapidez al manipular araña. </li><li> Ajuste la disección de magnificación del microscopio, el enfoque, y la fuente de luz hasta quelíceros de la araña y colmillos son claramente visibles. </li></ol> 4. Veneno Colección <ol><li> Encienda el vacío y spray quelíceros araña con una solución de agua con una segunda punta roma de la jeringa nEedle. Succionar el agua con la aguja de vacío para eliminar las impurezas. </li><li> Toque la aguja de vacío con electrodo negativo unido a tribuna araña y entregar impulsos con pedal de pie una o más veces. Vacío regurgitar de inmediato si es necesario. Nota: tribuna araña se encuentra dentro de la boca posterior a queliceras en la superficie dorsal entre quelíceros y enditos (ver Foelix 20 para la anatomía detallada de araña). Nota: Con cada impulso, el contrato de las piernas de la araña, y el veneno será visible en forma de gotas claras que salen de los colmillos. </li><li> Recoger las gotitas de veneno con punta microcapilar y punta capilar de transferencia en el tubo de 0.5 ml con agua o solución tampón (solución será absorbido por capilaridad). Nota: evitar perforar araña con capilar que puede conducir a la contaminación de la hemolinfa y la muerte. También evitar la contaminación de los capilares con seda y cola de hileras. </li><li> Adjuntar transferencia jeringa con adaptador de tubo para microcapilar (en el extremo opuesto a la punta de la colección) y dsolución de veneno ispense de nuevo en el tubo. Ponga el tubo en hielo. Nota: Deshágase de los capilares de residuos en un contenedor de objetos punzantes cerca. </li><li> Coloque plástico recoger abierto el vial, junto con su tapa, cerca de la araña. Sujete cuidadosamente las patas de araña con pinzas de disección roma a cabo en una mano y pluma cuidadosamente abierta fórceps dientes con la otra mano, araña cayendo en la recogida de vial con unas pinzas romas y rápidamente cierre la tapa. Continuar con los tubos que contienen veneno de araña-siguiente y almacenar en -80 ° C congelador cuando haya terminado. Nota: seguir ejerciendo cuidado al mover la araña de las pinzas de nuevo en el vial. Asegúrese de que el vial colector y la tapa es cercana a la araña para su rápida transferencia y usan guantes. </li></ol> 5. Veneno Glándula disecciones <ol><li> De dos a tres días después de la recolección de veneno, anestesiar araña en CO 2 cámara (consulte el paso 3.1). Rellene portador de nitrógeno líquido y el lugar junto al microscopio de disección. Nota: WHen trabajar con nitrógeno líquido, protección ocular y guantes de uso criogénicos. </li><li> Área de disección limpia y pinzas de disección con una solución que elimina RNasa y ADN contaminación. Llene una pequeña placa de Petri puesto bajo microscopio de disección con la disección de tampón (por ejemplo, citrato salino-sódico 1x (SSC) de amortiguación). </li><li> Araña de transferencia de CO 2 cámara de placa de Petri y el uso de fórceps para separar rápidamente el cefalotórax del abdomen. </li><li> Mantenga el cefalotórax bajo el microscopio de disección con una pinza y la posición de los quelíceros en el campo de vista. Utilice los afilados extremos de un segundo par de pinzas para cortar la cutícula de unirse a la caparazón de las caras laterales de los quelíceros. Lateralmente captar los quelíceros utilizando el segundo par de pinzas, y tirar suavemente hacia atrás y hacia delante hasta que las glándulas de veneno se sacan. </li><li> Glándulas separadas de los quelíceros (o salir unidos a queliceras si se desea) y la transferencia a un tubo de 0,5 ml cyrosafe. Coloque closed tubo en nitrógeno líquido. Nota: cada disección no debe tardar más de 15 min. </li><li> Repita la disección con arañas adicionales hasta que termine. Tubos de transferencia de nitrógeno líquido en -80 ° C congelador. </li></ol>

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El autor no tiene nada que revelar y no los intereses financieros de la competencia.

Venenos representan una importante fuente de proteínas fisiológicamente reactivos, péptidos y otras moléculas con aplicaciones para el descubrimiento de fármacos, así como para los aspectos fundamentales de la investigación celular y ecológica 1-3. Sin embargo, la colección de veneno, en particular de animales peligrosos o pequeños, es una tarea difícil. Este protocolo se muestra cómo glándulas de veneno y veneno se pueden recoger de las arañas viuda negra, y confirma el éxito de este enfoque a través de una combinación de análisis MudPIT del veneno y una base de datos proteína derivada de ADNc clonado a partir de veneno de las glándulas 21. Si bien este protocolo funciona bien para las viudas negras y arañas de tamaño medio, otras técnicas de recolección de veneno se han empleado para ampliar mygalomorph arañas (tarántulas-similares), como la aspiración directa de veneno de los colmillos en vidrio pipetas por ejemplo, 24. Este último enfoque, sin embargo , no va a funcionar bien para las arañas de menor tamaño que no se aggressicinco. Un aspecto especialmente crítico de la protocolo de recogida de veneno descrito aquí es las fases iniciales de preparación y optimización del proceso de recogida de manera que se hace más de rutina, consistente y más rápida. El protocolo es un principio difícil de dominar, pero con pruebas repetidas, se hace más fácil y más rápido. También se instó a la precaución en todas las fases críticas que involucran el manejo de arañas peligrosas, el uso de corriente eléctrica, de punta fina de cristal micro capilares, y agujas de jeringas. Es importante usar el equipo de protección personal adecuado, como guantes de nitrilo, una bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados, así como gafas de protección al dar forma a los micro capilares. Otro aspecto difícil de colección veneno es la pequeña cantidad de veneno producido por cualquiera de araña, particularmente especies de Latrodectus, de la cual las cantidades recogidas pueden ser limited a 1-2 microlitros por individuo en el mejor. La obtención de suficiente veneno para las aplicaciones posteriores, tales como geles de proteínas o ensayos funcionales puede requerir la combinación de veneno de varias personas en un solo tubo. En tales casos, el veneno sólo se debe combinar de individuos del mismo sexo, el estadio ontogénico, y la población recibió el reconocimiento de la variabilidad intersexual, de desarrollo y geográfica en algunos venenos de 25, 26. Las arañas también pueden presentar una variación considerable en la cantidad de veneno producido entre los individuos, en las cantidades menores siempre son representativas de la reciente destrucción de la glándula. Por lo tanto, puede ser aconsejable para recoger veneno de varios días después de su última alimentación. Si se libera poco veneno, exceso de corriente no debe aplicarse a la araña, que puede causar la cutícula se rompa, lo que conduce a la contaminación del veneno con hemolinfa o la muerte. La contaminación de las muestras de veneno de araña con SIfuentes lk o humanos también deben ser evitados a través del uso de material estéril o limpia. A pesar de estos desafíos, colección de veneno puro, dejando la araña viva, es preferible a los métodos que se obtienen a partir de homogeneizados de la glándula de veneno (que no se separan los componentes del veneno de otras proteínas celulares) y matan a la araña. También es fundamental para garantizar que las muestras se congelan rápidamente para evitar la degradación de proteínas. La extracción de veneno promueve la producción de veneno posterior, estimulando así la expresión génica en el veneno de la glándula de veneno. Por lo tanto, debido a este protocolo permite arañas para sobrevivir el agotamiento de veneno, sus glándulas pueden ser disecado varios días más tarde (matar la araña) en un punto donde se espera que la expresión de genes veneno para ser suficiente para los estudios genéticos, tales como la clonación de transcripción 10,11. Varios importantes precauciones también deben tenerse en disecciones de la glándula de veneno. Se debe hacer hincapié en el uso de equipm laboratorioent y reactivos que están libres de RNasas que degradan el ARN. Por lo tanto, se recomienda limpiar fórceps y otros equipos no desechables y superficies con soluciones que eliminan RNasa y ADN contaminación. Las disecciones deben realizarse lo más rápidamente posible y directamente congelado para garantizar aún más la integridad del ARN del tejido. Por último, las disecciones no se debe efectuar en arañas anestesiados, después de su cefalotórax y el abdomen se separan rápidamente. En conclusión, este artículo proporciona un protocolo verificada obtener glándulas de veneno de araña y veneno. Glándulas de veneno y veneno permiten el aislamiento y la caracterización de sus componentes de proteínas y péptidos utilizando enfoques proteómicos y transcriptomic. Además, las muestras de veneno pueden representar el punto de partida de ensayos funcionales, que determinan el potencial biomédico y farmacológico de sus moléculas constituyentes. Casi todas las arañas producen veneno, y la amplia buceadorsidad de componentes del veneno sintetizados por especies individuales sugiere una gran diversidad de moléculas del veneno están aún por descubrir 13. En consecuencia, este protocolo proporciona herramientas para investigar la fuente rica de moléculas biológicamente activas presentes en los venenos de araña.

Venenos son secreciones animales predominantemente inyectados en otro animal a los efectos de la depredación o la defensa, y también tienen importantes aplicaciones biológicas con relevancia biomédica 1-3. Sólo ciertos animales sintetizan veneno, pero su producción es taxonómicamente generalizada en invertebrados (por ejemplo, los cnidarios, caracoles cono, escorpiones y arañas) y vertebrados (por ejemplo, serpientes, algunos peces y mamíferos), debido a que ha evolucionado independientemente varias veces 1,4 . La caracterización bioquímica de los venenos muestran típicamente se componen de una amplia variedad de proteínas y péptidos, que actúan en gran medida de los sistemas circulatorio y nervioso de los animales inyectados para entregar rápidamente toxinas constituyentes 1. Una pequeña fracción de los animales venenosos puede representar una amenaza para los seres humanos, en particular las especies con distribuciones sinantrópicas 5. El estudio de la composición del veneno y las actividades funcionales ha jugado un papel importante enla caracterización funcional de los componentes celulares de vertebrados (en particular los canales iónicos neuronales) 6 y en la elucidación de los procesos celulares fundamentales (por ejemplo neurosecreción 7). Por otra parte, seleccione péptidos del veneno tienen propiedades útiles en contextos biomédicos, incluyendo sus usos como tratamientos para el cáncer y el dolor 8,9, y se extraen para los plomos de drogas candidatos y el desarrollo de antiveneno. Venenos también jugar un papel destacado en la investigación ecológica y evolutiva 1,4,10,11, por tanto, la colección de estas secreciones peligrosos tiene muchas utilidades. Hay&gt; 40.000 especies descritas de araña (orden Araneae), y todos menos uno de los más de 100 familias de arañas poseen pares de glándulas de veneno que terminan en 12 colmillos. La alta diversidad de especies de arañas sugiere que representan el mayor clado de organismos venenosos. Sin embargo, la caracterización bioquímica de venenos de araña tiene largely concentrado en un pequeño número de especies más frecuentemente asociados con envenenamiento humano. Recientes estudios de proteómica y transcriptómica de venenos de araña indican por lo general contienen muchas proteínas y péptidos 2,13,14 únicas. Los avances en alto rendimiento de secuenciación de ADNc y la espectrometría de masas de huellas dactilares péptido ha facilitado en gran medida el descubrimiento de estas proteínas de veneno de 15. Sin embargo, este trabajo comienza con la recolección de veneno suficiente y / o glándulas de veneno de las arañas, y la documentación detallada de estas técnicas son pocos 16. En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección de veneno y veneno de las glándulas de arañas viuda negra, que se puede aplicar a las arañas de tamaño similar. La colección de veneno por separado de las glándulas permite la identificación de proteínas que se secretan en el veneno en oposición a las proteínas que realizan otras funciones celulares. Las viudas negras y otra Latrodectus especies son ampliamente reconocidos entre las arañas más peligrosas debido a su veneno altamente neurotóxico, lo que provoca dolor severo en los seres humanos, que a veces se acompaña de sudoración profusa, contracciones musculares, hipertensión, dificultad para respirar y parálisis desigual 5. El protocolo de recogida de veneno que aquí se presenta utiliza electro-estimulación para suministrar corriente eléctrica a las arañas anestesiados para provocar contracciones musculares y la liberación de veneno. Gotitas de veneno se recogen rápidamente con micro-capilares y se dispensan en tubos para almacenamiento en el congelador. Debido a que el protocolo implica procedimientos peligrosos, sólo debe ser realizado por individuos bien entrenados y se instó a la precaución en pasos clave. El veneno de recogida tiene numerosos usos, como la caracterización y aislamiento de moléculas constituyentes 2, para experimentos o ensayos fisiológicos funcionales 18, y para estimular el veneno de la expresión del gen 11. El protocolo concluye con una description de la disección glándula de veneno y la preservación útil para la clonación de genes-veneno específica, la expresión de los que se ha demostrado que se producen 2-3 días siguientes agotamiento de veneno de arañas en diferentes 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Venenos son químicamente secreciones complejas que comprenden típicamente numerosas proteínas y péptidos con actividades fisiológicas variadas. Caracterización funcional de las proteínas del veneno tiene importantes aplicaciones biomédicas, incluyendo la identificación de los clientes potenciales de la droga o sondas para los receptores celulares. Las arañas son la mayoría de las especies ricas clado de organismos venenosos, pero los venenos de sólo unas pocas especies son bien comprendidas, en parte debido a la dificultad asociada con la recolección de pequeñas cantidades de veneno de animales pequeños. En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección de veneno de arañas utilizando la estimulación eléctrica, lo que demuestra el procedimiento de la viuda negro occidental (Viuda negra). El veneno de recogida es útil para diversos análisis aguas abajo, incluyendo la identificación directa de proteínas mediante espectrometría de masas, ensayos funcionales, y la estimulación de la expresión génica veneno para los estudios de transcriptómica. Esta técnica tiene la ventaja sobre los protocolos que isofinales de veneno de homogeneizados de la glándula enteros, que no se separan los componentes del veneno auténticos a partir de proteínas celulares que no son secretadas como parte del veneno. Los resultados representativos demuestran la detección de péptidos del veneno conocidos de la muestra recogida utilizando la espectrometría de masas. El procedimiento de recogida de veneno es seguido por un protocolo para la disección de las glándulas de veneno de araña, con resultados que demuestran que esto conduce a la caracterización de las proteínas y péptidos del veneno-expresado en el nivel de secuencia.

La colección de veneno y de las glándulas de veneno de las disecciones se realizan con frecuencia para caracterizar proteínas y péptidos del veneno en el plano secuencia 10,11,15. Veneno recogido puede usarse también en ensayos fisiológicos para determinar sus actividades funcionales 18. La colección de veneno estimulará la expresión del gen de la glándula de veneno, lo que facilita la clonación de las transcripciones de toxina específicos a través de RT-PCR 10,11. Identificación de proteínas del veneno se puede realizar también de una manera de alto rendimiento mediante la integración de técnicas de espectrometría de masas estándar con bases de datos de secuencia generados a partir de bibliotecas de ADNc de glándula de veneno 15,21. Un ejemplo de este tipo de trabajo, a partir de veneno y las glándulas recogidas utilizando el protocolo detallado anteriormente, lo que demuestra su eficacia, se ilustra en la Figura 1. Veneno de recogida de L. hesperus hembras adultas se digirió con tripsina y se sometieron a una solución enAnálisis MudPIT, que vincula la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) a la espectrometría de masas en tándem (MS / MS). Aquí el análisis MudPIT se llevó a cabo por la Universidad de Arizona Proteómica Consorcio. Las masas de péptidos detectadas y sus fragmentos disociados (iones hija, inferidos a partir de los espectros) se compararon con secuencias de péptidos predichos teóricamente a partir de las traducciones de las secuencias de ADNc obtenidas a partir de una biblioteca de expresión de gen construido a partir de L. hesperus glándulas de veneno (glándulas fueron adquiridos por el protocolo de disección se ha descrito anteriormente) 21. En este experimento, 36 proteínas se detectaron a partir de todos los espectros recogidos, en el umbral de probabilidad 99,9%, y contenían por lo menos un péptido detectados. Una de las proteínas detectadas se apoya en 43 espectros total (espectros ejemplar se muestra en la Figura 1A), correspondiente a tres péptidos exclusivos, que cubre 35% de la secuencia de la proteína (Figura 1B). La proteína detectada (traducido a partir de un collecte<html> d ADNc) tiene un éxito superior a BLASTp latrodectin de L. tredecimguttatus (GenBank adhesión P49125.1), con un e-score de 2e-46, y comparte el 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la proteína detectada en este experimento. Latrodectin, que también se conoce como la proteína de bajo peso molecular de alfa-latrotoxina, es un componente reconocido de veneno de arañas viuda negro 22, 23, la verificación de la eficacia del protocolo presentado. Algunas proteínas identificadas a partir del veneno corresponden a secuencias para el que se ha encontrado ningún hit BLAST. No está claro si este resultado se debe a los limitados recursos genómicos disponibles para las arañas, así como la información funcional limitada por sus proteínas, o porque la proteína desconocida representa un contaminante veneno. Sin embargo, el gen o los análisis de expresión de la proteína examen de la abundancia de una proteína tal novela en glándulas de veneno relativos a otros tejidos deben revelar si se trata de un componente de veneno genuino. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: péptido Latrodectin identificado del veneno de la viuda de negro utilizando la espectrometría de masa (A) espectros Representante (uno de 43) detectada a través de parte de MS / MS de análisis MudPIT de L.. hesperus veneno que se asignó a la traducción predicha de una secuencia de ADNc recogido se muestra en la parte B. Los espectros muestra relación masa a carga (m / z) de iones secundarios detectados en el eje horizontal producido por la fragmentación de péptido parental (CGEEDFGEEIVK), con letras en la parte superior fue asignado indicando la secuencia del péptido sobre la base de masas de iones hija. (B) de secuencias de proteínas a la que los espectros en la parte A, que muestra en rojo, negrita y subrayado de texto la secuencia correspondiente de los espectros se muestra en la parte A, el texto en rojo adicional (no negrita) representa otro péptido en esta proteína detectada con otra sp recogidaECTRA. La secuencia de la proteína se traduce de una secuencia de ADNc obtenido a partir de glándulas de veneno disecados.

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Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Este artículo proporciona un protocolo para la extracción del veneno de arañas utilizando la estimulación eléctrica con el fin de 1) llevar a cabo la caracterización proteómica, 2) estimular el veneno de la expresión del gen de la glándula, y 3) realizar estudios funcionales de venenos. Esto es seguido por una descripción de microdisecciones glándula de veneno para estudios de expresión génica.

La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

33.1K vistas.  University of Massachusetts Lowell.  Este artículo proporciona un protocolo para la extracción del veneno de arañas utilizando la estimulación eléctrica con el fin de 1) llevar a cabo la caracterización proteómica, 2) estimular el veneno de la expresión del gen de la glándula, y 3) realizar estudios funcionales de venenos. Esto es seguido por una descripción de microdisecciones glándula de veneno para estudios de expresión génica. 

Video: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separación electroforética de las proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Investigación

Biología

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

La toxina de inducción y extracción de proteínas a partir de Fusarium Spp. Los cultivos para los estudios proteómicos

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extracción y análisis de cortisol de Derechos Humanos y de mono de pelo

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

Extracción, etiquetado y purificación de células específicas del linaje de folículos antrales humanos

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Cría de escorpión amarillo brasileño para la extracción de veneno

Captive Maintenance and Venom Extraction of Tityus serrulatus (Brazilian Yellow Scorpion) for Antivenom Production

Scorpion envenomation is a public health problem in several tropical and subtropical countries. Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922 (Brazilian yellow scorpion) are responsible for approximately 150,000 envenoming cases per year in Brazil, of which 10% require antivenom treatment to reverse life-threatening venom effects. Therefore, thousands of T. serrulatus individuals are maintained under controlled captivity conditions for venom extraction, subsequently used in the production of the national supply of scorpion antivenom. Instituto Butantan is the main antivenom-manufacturing laboratory in Brazil, providing about 70,000 vials of scorpion antivenom for the Brazilian health system. Thus, the husbandry protocols and venom extraction methodologies are key points for the success of large-scale, standardized venom production. The objective of this article is to describe the captivity protocols of T. serrulatus husbandry, encompassing the husbandry routine and the venom extraction procedures, following good manufacturing practices, and ensuring animal welfare. These practices allow for the maintenance of up to 20,000 animals in captivity, with a routine of 3,000 to 5,000 scorpions milked monthly according to antivenom manufacturing demand, achieving an average of 90% of positive extraction.

Autor destacado: Optimización de la extracción de veneno de escorpión para la producción de antídotos 

Here, we present successful maintenance and venom extraction protocols for large-scale Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922 (Brazilian yellow scorpion) husbandry, with the aim of providing venom for subsequent scorpion antivenom production to meet the demand of the Brazilian health system.

Mantenimiento en cautiverio y extracción de veneno de Tityus serrulatus (escorpión amarillo brasileño) para la producción de antídotos

Scorpion envenomation is a public health problem in several tropical and subtropical countries. Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922 (Brazilian yellow ...