Agradecemos a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC) y la Sociedad Canadiense del Cáncer de apoyo financiero. SCCS gracias NSERC y VNL gracias al Ontario Graduate Scholarship (OGS) del programa de becas de postgrado. ARW gracias al CRC de una Cátedra de Investigación de Canadá.

Parte 1: Fabricación de dispositivos <ol><li> Sustratos de vidrio limpio en una solución Piranha (3:1 ácido sulfúrico concentrado:. 30% de peróxido de hidrógeno). Deja los sustratos en la solución Piranha durante 10 minutos con agitación frecuente. </li><li> Después de enjuagar en agua desionizada (DI) y el secado de los sustratos con N 2 gas, colocar los soportes en el interior de la cámara de haz de electrones para la deposición de cromo (espesor de 250 nm). </li><li> Para deshidratar el sustrato recubierto de cromo, enjuague con isopropanol y luego hornear en una placa caliente durante 5 minutos a 115 ° C. </li><li> Seque los sustratos e imprima con hexametildisilazano (HMDS) por spin-coating (30 s, 3000 rpm). Spin-abrigo de nuevo (con parámetros idénticos) con Shipley S1811 fotosensible. </li><li> Pre-hornear el sustrato en un plato caliente (100 ° C, 2 min), entonces el patrón fotosensible por la exposición a los rayos ultravioleta (UV) durante 5 s a través de una fotomáscara. </li><li> Desarrollar los sustratos UV-expuestos en Shipley MF 321 desarrolladores durante 3 minutos y lavar con agua DI. Después de cocer al horno en un plato caliente a 100 ° C durante 1 min. </li><li> Grabar el cromo expuestos por inmersión en cromo grabador durante 30 s. Enjuague con agua DI, a continuación, sumergirse en removedor AZ300T durante 10 minutos para eliminar el resto de fotosensible. Enjuague con agua y secar con DI N 2 gas. </li><li> Depósito de 2.5 micras Parileno-C (un aislante de polímero) por deposición química de vapor en una relación sustrato patrón de cromo. Depósito de 50 nm de teflón-AF (para hacer la superficie hidrofóbica) por una solución de spin-coating (1% p / p en Fluorinert FC-40) a 2000 rpm durante 60 s. Después de cocer al horno en un plato caliente (160 ° C, 10 min). </li><li> Para formar la placa superior, una capa. Sin patrón indio de óxido de estaño (ITO) sustratos de vidrio de 50 nm de teflón AF, como el anterior </li><li> Después de cocer ambos sustratos en un plato caliente (160 ° C, 10 min). </li></ol> Parte 2: Dispositivo de Configuración y Automatización <ol><li> En los dispositivos digitales de microfluidos funciona en &quot;dos placas&quot; de configuración, una gotas se sitúan entre un sustrato de fondo (con electrodos de patrones) y un sustrato superior (con un electrodo contiguos, transparente, normalmente formado por ITO). </li><li> Para configurar el dispositivo, retire los recubrimientos de polímeros de las almohadillas de contacto de un sustrato de fondo raspando suavemente con un bisturí. Par de la exposición de las pastillas de substrato del fondo con 40 pines (Figura 1a). </li><li> Energía en un equipo con LabView (National Instruments, Austin, TX), una casa construida caja de control (con una serie de relés de alto voltaje que son controlados por las señales de un DAQPad National Instruments), un generador de funciones, y un amplificador . La caja del equipo / control facilita el control del usuario sobre la aplicación de 100 V RMS / 18 kHz señales al dispositivo a través de los conectores de 40 pines. </li><li> Montar el dispositivo mediante la colocación de dos piezas de cinta de doble cara (140 micras de espesor total) en los bordes del substrato del fondo y completa con diapositivas sin patrón ITO (placa superior). </li><li> Para inicializar el sistema de control, ejecute el programa de calibración LabView (escrito en casa) para calibrar el control de retroalimentación. </li><li> Cargue la muestra y los reactivos en los depósitos adecuados (véase la sección 3, abajo) y escríbalos en la parte superior del sustrato (con revestimiento de teflón lado que mira hacia abajo). Conecte el conector de tierra en el sustrato superior. </li><li> Cargar el código de activación en LabView (escrito en casa) y ejecutar el programa para iniciar la actuación de las gotas. </li></ol> Parte 3: Preparación de la muestra y el reactivo <ol><li> Prepare el buffer de trabajo (WB): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) y 0,08% Pluronic F127 w / v. </li><li> Disolver la proteína (s) para ser analizados en la muestra del Banco Mundial y la pipeta en el depósito 1 (R-1) en el dispositivo, como se muestra en la Figura 1b. </li><li> Preparar ácido precipitante, el 20% tricloroacético (TCA) en agua DI, y la pipeta en R-2. </li><li> Prepare el tampón de lavado, 70/30 cloroformo / acetonitrilo (ACN) y pipetear en R-4. </li><li> Prepare el buffer de resolubilizing, 100 mM de bicarbonato de amonio (pH 8,0) y 0,08% Pluronic F127 w / v, y la pipeta en R-5. </li><li> Disolver tris reductor, (2-carboxietil) fosfina (TCEP), a 10 mM en el Banco Mundial y la pipeta en R-6. </li><li> Disolver agente alquilante, yodoacetamida (IAM), de 12 mm en el Banco Mundial y la pipeta en R-7. </li><li> Disolver la tripsina en el Banco Mundial a una concentración igual a 1 / 5 de la concentración de la muestra de proteína total (véase el apartado 3.1, arriba) y una pipeta en R-8. </li></ol> Parte 4: Procesamiento Digital de la muestra de microfluidos <ol><li> El siguiente procedimiento se lleva a cabo automáticamente por medio de código de LabVIEW escrito en casa. El volumen de las gotas de prescindir de los embalses está definido por las dimensiones de los electrodos (en este caso, las gotas son dispensados ​​~ 600nL). </li><li> Prescindir de una gota de proteínas que contiene la muestra de R-1 y una gota de precipitación a partir de R-2 (Figura 2, Cuadro 1). Combinar las dos gotas y permitir que la gota se combinaron para incubar durante 5 min, lo que resulta en la precipitación de los proteins sobre la superficie (Figura 2, Marcos 02.03). Accionar el sobrenadante lejos de la proteína precipitada al depósito de residuos, R-3 (Figura 2, Cuadro 4). </li><li> Prescindir de tres gotas de solución de lavado de R-4 y llevarlos al otro lado de la proteína precipitada al depósito de residuos, R-3 (Figura 2, Cuadro 5). </li><li> Permitir que el precipitado se seca, y aplique una gota de tampón resolubilizing de R-5 a la proteína. Deje que el buffer de incubación durante 20 minutos hasta que el precipitado se haya disuelto (Figura 2, Cuadro 6). </li><li> Prescindir de una gota de reductor de R-6 y fusionarla con la gota de la muestra. Mezclar la gota combinada de accionamiento que a través de 6 electrodos en un patrón circular. Permitir que la gota se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda (Figura 3, Marcos 02.01). </li><li> Prescindir de una gota de alquilante del R-7 y fusionarla con la gota de la muestra, seguido de la mezcla (como en 4.5). Permitir que la gota se incuba durante 15 min a temperatura ambiente en una cámara húmeda, protegido de la luz (Figura 3, Marcos 03.02). </li><li> Prescindir de una gota de la tripsina de la I-8, y fusionarla con la gota de la muestra, seguido de la mezcla (como en 4.5). Permitir que la gota se incuba durante 3 horas a 37 ° C en una cámara húmeda en una placa caliente (Figura 3, Marcos 04.03). </li></ol> Parte 5: Post-proceso de preparación de la muestra <ol><li> Quitar sustrato superior y la reacción de digestión apagar mediante la adición de 0,6 ml de 2,5% de ácido trifluoroacético en agua. </li><li> Purificar el producto de reacción apagado utilizando ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Diluir la muestra en agua purificada DI a un volumen final de 100 ml. </li></ol> Parte 6: Espectrometría de Masas <ol><li> Evaluar las muestras procesadas en un nano-HPLC acoplado a un espectrómetro de masas en tándem. El sistema HPLC utilizado es de Tecnologías de la Eksigent y está equipado con una columna de la trampa (3 mm de diámetro. Perlas de C18, 150 ID m x 2,5 cm) y una columna de separación en fase reversa (3 micras de diámetro. Perlas de C18, 75 m x ID 15 cm). El espectrómetro de masas se utiliza aquí es un LTQ de Thermo Fisher Scientific-. </li><li> Cargar una muestra de 2 l en la columna de la trampa en 5μL/min en una fase móvil que contiene 5% de acetonitrilo en agua. Separar la muestra en la columna de fase inversa en 0.5μL/min utilizando un gradiente lineal del 20% de acetonitrilo a acetonitrilo 80% más de 25 min. Continuar funcionando en acetonitrilo al 80% durante otros 10 minutos. </li><li> Analizar las bandas de elución de la columna por espectrometría de masas en tándem. En el trabajo aquí, el eluyente se recogen en el espectrómetro de masas a través de un emisor Nanoelectrospray (20 micras ID cónico de ID m 10) de NewObjective. </li><li> Identificar las proteínas en la muestra usando un programa de búsqueda de bases de datos tales como SEQUEST. En este trabajo se utilizó la versión de SEQUEST incorporado en BioWorks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), y las proteínas identificadas tenían puntuaciones de probabilidad de menos del 1,0 E-03 (equivalente al 99,9% intervalo de confianza), y la secuencia de las coberturas en por lo menos el 30% (Figura 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> Figura 1. (A) La imagen de un dispositivo acoplado a DMF de 40 pines para el accionamiento automático de gota. (B) un esquema de un dispositivo que muestra el posicionamiento de la muestra y los reactivos necesarios para una serie de análisis proteómico. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> Marcos Figura 2. A partir de una película que muestra la extracción automatizada y la purificación de la BSA en el 20% de TCA (precipitación) y acetonitrilo 70/30% de cloroformo / (solución de enjuague). En el marco de 6, la proteína precipitada se disolvió de nuevo en una gota de bicarbonato de amonio 100 mM. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> Figura 3. Fotogramas de una película que ilustra la reducción secuencial, alquilación, y la digestión de una gota de proteína resolubilizado. En esta figura, los reactivos son coloreados con tintes de claridad, en la práctica, los reactivos no son de colores. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> Figura 4. MS cromatograma de una muestra de albúmina sérica bovina procesada por microfluídica digital. 25 péptidos distintos fueron identificados (99,9% intervalo de confianza) correspondiente a una secuencia de la cobertura del 44%.

<ol>
	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

La falta de manejo de las muestras estandarizadas y el procesamiento de la proteómica es una limitación importante para el campo. Además, el manejo convencional de la muestra macroescala implica varios contenedores y las transferencias de solución, que puede conducir a la pérdida de muestra y la contaminación. Una posible solución a estos problemas es la formación de sistemas integrados para el procesamiento de las muestras dependen de microfluidos digitales 1 (DMF). En trabajos anteriores, DMF ha dem...

digital microfluidics for automated proteomic processing

Proteómica clínica se ha convertido en una disciplina nueva e importante, con la promesa del descubrimiento de biomarcadores que sean útiles para el diagnóstico precoz y pronóstico de la enfermedad. Mientras que los métodos de proteómica clínica varían mucho, la característica común es la necesidad de (i) la extracción de proteínas a partir de los líquidos extremadamente heterogénea (es decir, suero, sangre, etc) y (ii) procesos de transformación extensiva bioquímicos antes del análisis. Aquí, se presenta un nuevo microfluídica digital (DMF) método basado en la integración de varios pasos de procesamiento utilizadas en proteómica clínica. Esto incluye la extracción de proteínas, resolubilization, reducción, alquilación y digestión enzimática. Digital microfluídica es un micro manejo de fluidos técnica en la cual las gotas de nanolitros microlitros de tamaño se manipulan en una superficie abierta. Las gotas se colocan en la parte superior de una matriz de electrodos que están recubiertas por una capa dieléctrica - cuando un potencial eléctrico se aplica a la gota, los cargos se acumulan a ambos lados del dieléctrico. Los cargos de servir como maneja electrostática que se pueden utilizar para controlar la posición de las gotas y por sesgar una serie de electrodos en serie, las gotas se pueden hacer para dispensar, mover, unir, mezclar y dividir en la superficie. Por lo tanto, DMF es un ajuste natural para la realización rápida de varios pasos secuenciales, ensayos bioquímicos en miniatura automática. Esto representa un avance significativo sobre los métodos convencionales (basándose en pipeteo manual o robots), y tiene el potencial de ser una herramienta útil en la nueva proteómica clínica. Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, y Steve CC Shih contribuyeron igualmente a este trabajo. Dirección actual Sergio LS Freire es de la Universidad de las Ciencias en Filadelfia ubicado en el 600 Sur de la Calle 43, Philadelphia, PA 19104.

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Microfluídica digital es una técnica caracterizada por la manipulación de las gotas discretas (~ NL - mL) en una matriz de electrodos en la aplicación de campos eléctricos. Es muy adecuado para llevar a cabo rápida y secuencial, en miniatura ensayos bioquímicos automatizados. Aquí, se presenta una plataforma capaz de automatizar varios pasos de procesamiento de proteómica.

Microfluídica digitales para el procesamiento automatizado de Proteómica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vistas.  University of Toronto. Microfluídica digital es una técnica caracterizada por la manipulación de las gotas discretas (~ NL - mL) en una matriz de electrodos en la aplicación de campos eléctricos. Es muy adecuado para llevar a cabo rápida y secuencial, en miniatura ensayos bioquímicos automatizados. Aquí, se presenta una plataforma capaz de automatizar varios pasos de procesamiento de proteómica.

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Respuesta quimiotáctica de los microorganismos marinos a escala micro nutrientes Capas

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Investigación

Biología

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Los estudios de quimiotaxis bacteriana utilizando microfluídica - Entrevista

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

La aplicación de microfluídica para Electrofisiología

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separación electroforética de las proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

El análisis por inmunotransferencia

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Tinción de proteínas en geles de

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

La toxina de inducción y extracción de proteínas a partir de Fusarium Spp. Los cultivos para los estudios proteómicos

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...