Este trabajo fue apoyado por una subvención NSF RUI de MCB-0950372 titulado Caracterización molecular de la Seda Negro Araña Viuda.

1. Anestesiar a la araña y el aislamiento del abdomen <ol><li> La transferencia de la araña de un frasco de vidrio en una caja de cartón forrada con plástico (Figura 1). Por lo general recogen las arañas de las pilas de madera, garajes o arbustos y la casa en el laboratorio en frascos de vidrio. Debido a que la araña no puede subir por las paredes de plástico, que proporciona un método eficiente para la transferencia de la araña de un frasco de vidrio o lata de café en un frasco más pequeño para fines de anestesia. Durante la manipulación de la araña en este punto, usted debe usar dos pares de guantes de látex o guantes de jardinería para la seguridad. </li><li> Mientras que la araña se encuentra en la caja forrada de plástico, el enfoque de la araña de su espalda y dejó caer la araña en el vial de la cultura de plástico. Después de la araña entra en el vial, inmediatamente coloque el enchufe en la parte superior (fig. 1B). Le recomendamos que utilice un vial que es de aproximadamente 101,6 mm x 31,75 mm (L x D). Esto minimiza la cantidad de dióxido de carbono necesarios para el paso de anestesia. </li><li> Anestesiar a la araña con la introducción de gas de dióxido de carbono a 10.5 libras por pulgada cuadrada de 10 min (fig. 1C). Esta cantidad de gas sólo se va a eliminar la araña a cabo por alrededor de 5 minutos, así que después de anestesia que de inmediato debe proceder a los pasos 1.4-1.5. </li><li> Coloque la araña anestesiados en un plato pequeña disección y el uso de fórceps para la posición de la araña a la cara dorsal (reloj de arena hacia abajo). </li><li> Clip del pedicelo (tallo delgado que conecta el cefalotórax y el abdomen) para liberar el abdomen del resto de la araña (Figura 1D). Guarde el cefalotórax en el congelador durante la noche en una placa de Petri y deseche después de congelado al día siguiente. Tenga cuidado al mover el cefalotórax como los colmillos de la araña están presentes en este segmento. </li><li> Fije el abdomen con el material Sylgard en el plato pequeña disección utilizando un alfiler insecto. Inserte el pasador de los insectos a través del agujero hecho en el recorte del pedúnculo (Figura 1). Esto puede ser fácilmente identificado como el sitio donde el líquido está saliendo de la saturación del pedúnculo. Asegúrese de que la hilera (extremo opuesto del pedúnculo) está orientado hacia la parte inferior (la más cercana a usted). </li></ol> 2. La eliminación del exoesqueleto <ol><li> Hacer la primera incisión a través del exoesqueleto con un par de micro tijeras, empezando por el agujero de la saturación del pedúnculo. Corte lateralmente hasta la cara dorsal se alcanza en ambos lados (Figura 1 F). Con un par de pinzas, pele el segmento de exoesqueleto anterior e insertar un segundo pasador en este lugar. Después de la inserción de la espiga en segundo lugar, a su vez la bandeja de disección de caudal (90 °) a partir de los cortes laterales inicial y seguir cortando hasta que las hileras se alcanzan (Figura 1G). Esta incisión será perpendicular o vertical para el corte lateral inicial. No corte a través de las hileras, cuando la incisión vertical se hace (en relación posterior a la del reloj de arena y tiene un aspecto circular). La falta de insertar el pasador de segundo resultado en el abdomen de girar cuando las incisiones verticales se llevan a cabo. </li><li> Sumerja el abdomen en la disección de solución tampón (0,1 M de cloruro de sodio, citrato de sodio 0,015 M, un 0,1% dietil pirocarbonato). </li><li> Pelar el exoesqueleto restantes a partir de la incisión inicial, lateral. Cuando se termine esto, el tejido graso debe ser claramente visible (Figura 1H). </li></ol> 3. El aislamiento de las glándulas productoras de seda <ol><li> Utilizando unas pinzas empiezan las burlas de distancia de la capa de grasa (Figura 1H). La grasa tiene un color blanquecino de aspecto amarillento. Continúe hasta que la mayor parte de la grasa se elimina y las glándulas de seda son claramente visibles. La glándula tubuliform consta de tres pares de mucho tiempo, tubos cilíndricos que son abundantes en la cavidad abdominal. El ampullate principales, que se encuentra en parejas, es una ampolla grande, forma de media luna con una larga cola de contorneado distal y proximal de un conducto que la disminución de anchura que se acerca a las hileras de la araña. El ampullate menores es muy similar en morfología a la ampullate importante, pero es significativamente menor. La glándula flagelliform, también se producen en pares, es redondo y multilobular de un tanque pequeño zig-zag del conducto que se extiende hacia abajo, hacia las hileras. La glándula agregada (que se encuentran en pares) es un muy grande, la glándula multinodular que tiene un conducto excretor muy grande que tiene grandes lóbulos, irregular en él. Las glándulas aciniform se producen en grandes cantidades y se asemejan a las proyecciones a corto, con forma de dedo pequeño. La glándula piriforme es la más pequeña glándula en el abdomen y tiene muchas vías compacta, cilíndrica que se asemejan a un ventilador con muchos pequeños conductos excretores que se extienden hasta las hileras. </li><li> Le recomendamos que quite las glándulas en el siguiente orden: tubuliform, ampullate importante, flagelliform, ampullate menor de edad, total, aciniform, y luego el piriforme (Figura 2A-B). </li><li> A partir de la tubuliform, se burlan de estas glándulas fuera del resto de thglándulas e - que debe estar sentado en la parte superior de las otras glándulas (Figura 2A). Hay tres pares de glándulas tubuliform en una sola araña. Les permiten flotar libremente, pero permanecer unidos a sus hileras de sus conductos. </li><li> A continuación, se burlan de distancia de las glándulas ampullate importante. Hay dos glándulas ampullate principales presentes en una araña. Durante el procedimiento de extracción, asegúrese de que los conductos de permanecer unidos a las glándulas (Figura 2A). </li><li> Seguir para molestar a los demás de las glándulas de distancia el uno del otro, trabajando con cuidado para evitar la perforación de cualquiera de las glándulas, sobre todo el conjunto y las glándulas flagelliform. Cada glándula debe ser de libre flotación todo el camino hasta su punto de salida en el exoesqueleto de las hileras. Estas glándulas se encuentran también en pares. Retire cada glándula apretando el conducto con una pinza y con mucho cuidado tirando hasta que se rompe con el punto de salida. El ampullate importante, flagelliform, ampullate menor de edad, y las glándulas agregado se encuentran en pares. Las glándulas aciniform piriforme y se producen en muchos pares más. </li><li> Retire cada glándula apretando el conducto con una pinza y con mucho cuidado tirando hasta que se rompe con el punto de salida por la hilera. Por lo general almacenar las glándulas húmedo, sin embargo, no añadimos tampón adicionales. </li><li> Como las glándulas se retiran, los coloca en el estéril pre-etiquetados de microcentrífuga de 1,5 ml. Glándulas individuales se muestran en la Figura 3-G. Mantenga estas glándulas en hielo y luego Flash congelarlos en nitrógeno líquido. Tras la congelación de flash en nitrógeno líquido, los colocan a -80 ° C para su almacenamiento. </li></ol> 4. Resultados representante Al extraer las glándulas diferentes, el cuidado extremo se debe tomar en la manipulación del flagelliform y las glándulas agregado, ya que estas dos estructuras pueden ser fácilmente perforados y dañados con las pinzas. Por otra parte, cabe destacar que morfológicamente las glándulas flagelliform y agregados son muy similares antes de su retirada y que a menudo se entrelazan unos con otros. Para evitar la contaminación cruzada de estos tejidos después de la retirada, el disector cuidadosamente burlan de estas estructuras de separación. Además, en la exposición inicial de las glándulas productoras de seda, las glándulas aciniform y piriforme será el más difícil de visualizar de inmediato debido a su menor tamaño y localización anatómica. A menudo no es la presencia de muchos huevos. Por otra parte, la atención de las necesidades adicionales que deben adoptarse cuando la eliminación de la glándula piriforme, ya que este tejido es muy pegajosa y con frecuencia se adhiere a su fórceps. Cuando este procedimiento se realiza correctamente, es posible obtener las siete glándulas productoras de seda de la araña solo de una manera altamente purificada. Por lo general, se puede recuperar cantidades de microgramos de RNA total y proteínas a partir de una disección de la araña sola. Un ejemplo del uso del ARN total de qPCR para examinar los niveles de ARNm de un gen tubuliform restringido fibroína, TuSp1, se muestra (Figura 4). Representante experimentos que involucran proteínas lisados ​​recogidos de las glándulas, por ejemplo en la solución de digestión tríptica seguido por el análisis de MS (también podrían ser utilizados para análisis MS / MS) o un análisis de composición de aminoácidos se muestra (Figura 5.6, respectivamente). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figura 1e" /> Figura 1. Manipulación, anestesiar, y la eliminación del exoesqueleto del abdomen de una araña viuda negro femenino. A) La transferencia de la araña en una caja de cartón forrada con plástico para facilitar el movimiento de la araña en un frasco de plástico más pequeñas. B) Spider coloca en un frasco de plástico con tapón. C) La anestesia de la araña con el gas de dióxido de carbono. D) La separación del cefalotórax del abdomen utilizando micro tijeras. E) La inmovilización del abdomen en la bandeja de disección con alfileres de insectos. F) Vista después de una incisión lateral se hace con las tijeras y una parte del exoesqueleto se repicaron de nuevo con las pinzas. G) Las incisiones que se hizo el corte perpendicular al lateral inicial. H) La eliminación del exoesqueleto y la exposición de la capa de grasa. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualización de los siete diferentes glándulas productoras de seda, mientras permanezca intacto en el abdomen de la araña, así como los tejidos circundantes. A) Las imágenes de la tubuliform, ampullate importante, flagelliform, tejidos agregado, ampullate menores con un aumento de 12X. B) Imagen de la aciniform piriforme y glándulas con un aumento de 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figura 3e" /> Figura 3. Fotografías de las siete glándulas productoras de seda después de su eliminación del abdomen. Todas las imágenes fueron captadas a 20X, con la excepción de la aciniform y las glándulas piriforme, que se realiza a 40X. Una de las principales)ampullate glándula; B) ampullate mayores y menores (lado derecho) para la comparación de tamaño; C) tubuliform; D) flagelliform; E) total; F) aciniform; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Los resultados representativos del patrón de expresión del gen de la seda, TuSp1, después de examinar el TuSp1 niveles de mRNA en la producción de diferentes glándulas de seda (con exclusión de la glándula piriforme) utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) de aislamiento tras de ARN total de las glándulas. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Ejemplo de análisis de MS de extractos de proteínas obtenidos a partir de la glándula piriforme después de la digestión en solución tríptico. Nota: x2 representa 2 veces el aumento de la intensidad del espectro. Espectro de masas de iones de péptidos que corresponden a las regiones de la fibroína PySp1 se muestran con el símbolo #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Resultado típico del perfil de composición de aminoácidos de las proteínas extraídas de la glándula tubuliform. Nota: ASX = Asp y Asn; GLX = Glu y Gln. Coloración azul refleja aminoácidos con grupos polares de la cadena lateral, mientras que la coloración roja representa los residuos de aminoácidos con grupos no polares de la cadena lateral.

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	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

Nuestra metodología para la microdisección de las glándulas productoras de seda de la araña viuda negro ofrece un medio eficaz para obtener altamente purificada producir seda glándulas. Disecciones se puede completar en 1,5 a 3 horas, produciendo un conjunto completo de las siete distintas glándulas productoras de seda de cobweavers. La obtención de alta pureza glándula de seda muestras permite a los investigadores la posibilidad de realizar una amplia gama de estudios bioquímicos, incluyendo la identificación...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Arañas modernas giro fibras de alto rendimiento de seda con una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la captura de presas de locomoción, y la protección del desarrollo de 1,2 hijos. Arañas realizar estas tareas al girar varios tipos de fibras distintas que tienen diferentes propiedades mecánicas. Esta especialización de los tipos de fibra se ha producido a través de la evolución de las diferentes glándulas productoras de seda, que funcionan como biofábricas pequeños. Estos fabricación biofábricas y almacenar grandes cantidades de proteínas de seda para la producción de fibra. A través de una serie compleja de eventos bioquímicos, estas proteínas de la seda se convierten de un líquido en un material sólido con la extrusión. Estudios de mecánica han demostrado que las sedas de araña es más fuerte que acero de alta resistencia 3. Los análisis para comprender la relación entre la estructura y función de hilos de seda de araña han revelado que la seda de araña consiste en gran parte de las proteínas, o fibroins, que se repite dentro de su bloque de secuencias de proteínas 4. Común firmas moleculares que contribuyen a la resistencia a la tracción increíble y la extensibilidad de las sedas de araña se deshizo a través del análisis de ADNc de seda traducido. Teniendo en cuenta las propiedades del material extraordinario de araña sedas, los laboratorios de investigación en todo el mundo están compitiendo para comprender y simular el proceso de hilado para producir fibras sintéticas de seda para aplicaciones comerciales, industriales y militares. Uno de los principales desafíos a la hilatura de seda de araña artificial en el laboratorio de investigación consiste en un completo entendimiento de los procesos bioquímicos que ocurren durante la extrusión de las fibras de las glándulas productoras de seda. Aquí presentamos un método para el aislamiento de los siete productores de seda diferentes glándulas de la araña viuda cobweaving negro, que incluye las glándulas ampullate mayores y menores [fabrica de seda draga y andamios] 5,6, tubuliform [huevo sintetiza seda caso] 7 , 8, flagelliform [función desconocida en la mazorca de los tejedores], agregado [hace cola de seda], aciniform [envolver la presa sintetiza las discusiones y huevo caso] 9 y piriforme [archivo adjunto produce seda disco] 10. Este enfoque se basa en anestesiar a la araña con el gas de dióxido de carbono, la posterior separación del cefalotórax del abdomen, y microdisección del abdomen para obtener las glándulas productoras de seda. Tras la separación de los diferentes productores de seda glándulas, estos tejidos se pueden utilizar para recuperar las macromoléculas diferentes para los distintos análisis bioquímicos, incluyendo cuantitativos PCR en tiempo real, en el norte y el Western Blot, análisis de espectrometría de masas (MS o MS / MS) para identificar nuevas secuencias de proteínas de seda, la búsqueda de proteínas que participan en la ruta de la seda de montaje, o usar el tejido intacto para el cultivo celular o histológico experimentos.

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K vistas.  University of the Pacific. A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.

Video: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Investigación

Biología

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

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Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

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