La interacción de la toxina de la anémona de mar debe utilizar el menor número de organismos y protocolos eficientes para obtener una gran diversidad y abundancia de las toxinas y la rápida identificación de una toxina específica. Combinamos dos técnicas eficientes para preparar el extracto crudo con una alta cantidad de proteína y describir ensayos reproducibles, específicos, rápidos y económicos para identificar la hemólisis y las bases fosfólicas en el veneno de anémona de mar. El método se puede utilizar en casi cualquier ejemplo que se decida identificar uno o ambos tipos de citolisinas.
La eficiencia del método se logra cuidando los tiempos en cada paso mientras se prepara el extracto crudo. La clave de la hemólisis es el manejo cuidadoso del eritrocito para evitar la lisis mecánica, y en el ensayo de fosfólisis, cuidar la temperatura en la preparación de la placa. Demostrando el procedimiento estarán el Dr. Santos Ramírez-Carreto, la bióloga Sandra Salazar García y el biólogo Giovanni Macías Martínez de mi laboratorio.
Comience limpiando la anémona de mar A.doi recolectada con agua destilada a mano para eliminar las grandes partículas de sustrato que se adhieren al cuerpo. Congelar inmediatamente los organismos a menos 80 grados centígrados en un ultracongelante durante 72 horas. Luego, coloque los organismos en vasos especiales para liofilización con condiciones de liofilización durante 48 horas.
Para la hidratación de los tejidos, reconstituya 20 gramos de peso seco de organismos liofilizados con 60 mililitros de tampón de fosfato de sodio 50 milimolar y una tableta de cóctel inhibidor. En un agitador magnético, revuelva continuamente la muestra a alrededor de 800 RPM y cuatro grados Celsius durante 12 horas. Después de congelar la muestra a menos 20 grados centígrados durante 12 horas para inducir la lisis celular y la descarga de nematocistos, coloque el recipiente en agua a temperatura ambiente hasta que se descongele hasta un 90%Repita este procedimiento tres veces.
Para aclarar el extracto, centrífuga la muestra a 25, 400 veces G durante 40 minutos a cuatro grados centígrados. Recupera el sobrenadante y centrífuga de nuevo. Repita el paso tres o cuatro veces y recupere el sobrenadante por fin.
El sobrenadante recuperado o extracto crudo contiene los componentes del veneno y otras moléculas celulares como lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos. Determine la concentración de proteínas del extracto crudo utilizando un kit de ensayo colorimétrico comercial de Bradford. Incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar.
Luego, mida la absorbancia a 595 nanómetros. Trazar los promedios de las absorbancias BSA de la muestra y determinar la ecuación del gráfico donde y es la absorbancia, m es la pendiente de la recta, x es la concentración de proteínas y b es la ordenada al origen. Para analizar el extracto crudo, agregue 30 microgramos del extracto crudo a cinco microlitros del tampón de carga de proteínas para desnaturalizar las proteínas.
El volumen final debe ser inferior a 50 microlitros. Ejecute la electroforesis a 25 miliamperios constantes durante una hora y 30 minutos. Para evitar la difusión de las proteínas del gel, agregue la solución de fijación a las proteínas e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos con agitación a 80 RPM.
Luego, decante la solución y agregue la solución de reticulación de proteínas. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 80 RPM. Retire la solución y lave el gel con 100 mililitros de agua destilada durante cinco minutos.
Después de eso, retire el agua y repita este procedimiento cuatro veces. Realice la tinción de proteínas con 50 mililitros de solución filtrada Coomassie Brilliant Blue R-250 agitando a 60 RPM en un oscilador rotativo de laboratorio a temperatura ambiente durante 15 minutos. Extraiga un mililitro de sangre de la vena yugular de una oveja y retire la aguja de la jeringa.
Drene inmediatamente la sangre en un tubo con 50 mililitros de solución de Alsever y centrífuga a 804 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y agregue 30 mililitros de solución de Alsever deslizándolo a lo largo de las paredes internas del tubo. Resuspender lentamente el pellet con una pipeta de plástico Pasteur y centrifugar la solución de nuevo a 804 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Repita este procedimiento hasta que se aclare el sobrenadante. Mantener el volumen final de la solución de Alsever para lograr una concentración de 2 millones de células por mililitro aproximadamente. Luego, use una cámara neubauer o un hemocitómetro para contar las células.
Incubar las mezclas de solución durante una hora a 37 grados Celsius sin agitar y luego centrifugar la placa a 804 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Recupere el sobrenadante en otra placa de 96 pocillos con fondo plano. Si el extracto crudo contiene citolisinas, los eritrocitos lisarán y liberarán hemoglobina.
Lea la absorbancia a 415 nanómetros y calcule la cantidad de extracto que produce hemólisis en el 50% de los eritrocitos. Aumente la cantidad de extracto crudo de anémona de mar y diseñe la parcela con ajustes sigmoidales utilizando el software adecuado. Lave un huevo de gallina con 1% SDS en agua destilada y separe la yema de huevo de la clara de huevo en condiciones estériles.
Prepare las soluciones A, B, C y D.Agregue 500 microlitros de las soluciones A y C a la solución B y 100 microlitros de la solución D.Mezcle y vierta 25 mililitros en cada placa de Petri. Espere a que la solución se solidifique en condiciones estériles y haga pocillos de aproximadamente dos a tres milímetros de diámetro con un tubo delgado. Agregue un total de 20 microlitros de tampón de fosfato como control negativo en un pozo y 20 microlitros de una fosfolipasa determinada como control positivo en otro pozo.
Coloque diferentes cantidades de la proteína de extracto crudo 5, 15, 25, 35 y 45 microgramos en los pocillos restantes, cada uno en un volumen final de 20 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 horas. Los resultados representativos del protocolo utilizado para obtener el extracto crudo de anémona de mar mostraron que combinando dos técnicas, agitación y ciclos de congelación y descongelación, produjo una descarga eficiente de nematocistos.
Los nematocitos antes y después de los estímulos se muestran aquí. El túbulo del nematocisto está expuesto en esta imagen, lo que indica la liberación de toxinas. El perfil electroforético del extracto crudo de anémona de mar se muestra aquí.
El extracto crudo de anémona de mar fue analizado por SDS-PAGE 15%polyacrylamide gel y mostró proteínas de 10 kilodaltons a 250 kilodaltons de peso molecular. Aquí, el carril 1 es la escalera de proteínas y el carril 2 es el veneno de anémona de mar. Se detectaron citolisinas en la zona de peso molecular de 15 kilodaltons y 20 kilodaltons.
Aquí se muestra el ensayo de hemólisis en eritrocitos de ovejas. La actividad hemolítica del extracto antes y durante los ciclos de congelación y descongelación aumentó hasta alcanzar el 100% de hemólisis con 50 microgramos de la proteína total del extracto crudo en los dos últimos ciclos. La cantidad necesaria para lisar el 50% de eritrocitos de oveja es de 11,1 0,3 microgramos por mililitro.
La actividad de la fosfolipasa se detectó mediante la formación de halos claros en las áreas de la placa de agar donde se aplicó la muestra de extracto crudo. Los resultados muestran la presencia de actividad fosfolipasa a partir de 15 microgramos de proteína total. El diámetro del halo aumentó de una manera dependiente de la dosis; es decir, si la cantidad de extracto crudo aumentó, el diámetro del halo aumentó.
Mientras intenta el procedimiento, asegúrese de inducir la descarga de nematocistos, cuantificar la proteína total, analizar el extracto crudo por electroforesis SDS-PAGE, calcular la cantidad de proteína de extracto crudo para producir el 50% de la hemólisis y usar diferentes cantidades de proteína en el ensayo de fosfolipasa. Podemos analizar el extracto crudo por técnica proteómica para identificar polipéptidos con gran relevancia en biotecnología y biomedicina, incluso perfilar y caracterizar una molécula única y luego producirla en el laboratorio para una aplicación. Se obtuvo parte de la secuencia de una proteína ejecutora con actividad antitumoral en las células epiteliales del carcinoma de pulmón obstruido humano.
Asimismo, identificamos la secuencia de fosfolipasas de interés biotecnológico.
