El análisis del transcriptoma en células individuales o tipos de células puede detectar la sutil diferencia de la expresión génica enmascarada por la heterogeneidad, que es una herramienta poderosa para descubrir los elaborados mecanismos reguladores intracelulares. La clasificación celular activada por fluorescencia seguida del análisis RN-seq se puede realizar en modo de celda única o de tipo de celda a granel con alta sensibilidad de detección de transcripción y compatibilidad con otros enfoques multiómicos. Los usuarios primerizos de este protocolo deben prestar atención a algunos pasos en la clasificación de protoplastos y la preparación de la biblioteca RNA-seq.
Junto con Jun Zhang, el Dr. Rongrong Xie, un post-doc en nuestro laboratorio, ayudará a demostrar el procedimiento. Para comenzar, coloque las semillas de Arabidopsis thaliana wild type y fluorescent marker line en lejía al 20% e incube usando una incubadora giratoria a temperatura ambiente durante 15 minutos para esterilizar las semillas. Mientras trabaja en un banco estéril, enjuague las semillas de tres a cinco veces en agua destilada doble.
Coloque en placa las semillas de tipo silvestre y línea reporter en medio MS de fuerza media con 0.8% de peso por volumen de agar. Estratificar las plantas durante dos días a cuatro grados centígrados. Luego cróquelos verticalmente durante cinco días a 23 grados centígrados bajo ciclos de luz de 16 horas y ciclos oscuros de 18 horas.
Descongele suavemente las soluciones de protoplasting denominadas solución A y solución B en hielo antes del experimento. Corte las raíces de las plantas con una cuchilla limpia o tijeras y corte las raíces en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros. Sumerja las raíces picadas en 1,5 mililitros de solución B seguido de una rotación suave a temperatura ambiente durante 1,5 a 2 horas.
Filtrar los protoplastos radiculares resultantes a través de una malla filtrante de 40 micras y enjuagar la malla con uno o dos mililitros de solución A.Centrifugar los filtrados combinados a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante con una pipeta, resuspenda el pellet celular en 500 a 600 microlitros de solución A y colóquelo en hielo inmediatamente. Para la clasificación celular, transfiera la solución celular resuspendida a un nuevo tubo de ensayo de cinco mililitros.
Llene el tanque de fluido de la vaina y verifique el tanque de desechos. Luego encienda la máquina de clasificación de células activada por fluorescencia o FACS. Lleve a cabo los pasos de configuración del instrumento y calibración automática en el clasificador.
Seleccione los canales de fluorescencia y use una planta de tipo silvestre sin fluorescencia como control de referencia. Ajuste la puerta de clasificación en función de la intensidad de fluorescencia y los singles de dispersión directa y dispersión lateral. Después de agregar 500 microlitros de solución A en un tubo de recolección de 1.5 mililitros, comience a clasificar y recolecte de 2, 000 a 3, 000 células por tubo.
Después de clasificar, coloque inmediatamente las muestras en hielo. Centrifugar el tubo de recolección que contiene las células a 300 G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta. Tome dos microlitros de células clasificadas y verifique la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia.
Almacene las celdas clasificadas a menos 80 grados centígrados si no se usa inmediatamente. Para la clasificación del índice de una sola celda, coloque la placa de 96 pocillos con membrana en el adaptador. Calibre la posición de la placa para que la gota caiga en el orificio central de la placa.
Retire la membrana de la placa de 96 pocillos y coloque la placa de 96 pocillos en el adaptador. Seleccione el modo de clasificación de celda única al ordenar. Introduzca el número objetivo de celdas ordenadas como una sola y comience a ordenar.
Antes de comenzar el experimento, limpie el banco con un descontaminante superficial y etanol al 75%. Utilice todo el equipo solo para la preparación de la biblioteca de secuenciación. Después de agregar un microlitro de mezcla A recién preparada a la muestra clasificada, muélala con un mortero estéril.
Usando agua libre de ARNasa, enrasar el volumen a 14 microlitros. Luego transfiera cada muestra en un tubo de PCR de pared delgada de 0.2 mililitros. Luego prepare la mezcla B.Agregue 4.4 microlitros en la mezcla B a cada tubo de PCR que contenga muestras y mezcle con un pipeteo suave.
Incubar las muestras a 72 grados centígrados durante tres minutos. Después de la incubación, coloque inmediatamente las muestras en hielo para hibridar el oligo dT a la cola poli-A. Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa o mezcla C en un microlitro de 21,6 microlitros de la misma a cada tubo que contenga las muestras.
Someter las muestras a una reacción de transcripción inversa en un instrumento de PCR común según el programa de transcripción inversa. Agregue 40.8 microlitros de la mezcla de reacción de preamplificación recién preparada o la mezcla D al producto de reacción de transcripción inversa y ejecute el programa de preamplificación. El ciclo de amplificación se puede determinar mediante PCR cuantitativa cuando la reacción acaba de entrar en la fase exponencial.
Para purificar los productos de reacción de preamplificación, transfiera los productos preamplificados de un tubo de PCR a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue 48 microlitros de perlas AMPure XP en cada muestra y mezcle suavemente con pipeteo antes de la incubación. Coloque los tubos de 1,5 mililitros que contienen las muestras y las perlas en un soporte de separación magnética durante cinco minutos.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante de las muestras sin alterar las cuentas. Después de resuspenderlos en 200 microlitros de etanol al 80%, colóquelos en el soporte de separación magnética durante otros tres minutos. Después de desechar el sobrenadante que contiene etanol, seque las muestras al aire en un tubo durante 10 minutos.
Resuspender las perlas en 20 microlitros de agua libre de nucleasas e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego colóquelos en el soporte de separación magnética durante cinco minutos. Con una pipeta, transfiera 18 microlitros del sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.
Finalmente, siga los pasos descritos en el texto para caracterizar la prebiblioteca, seguido de la construcción, purificación y cuantificación de la biblioteca. Las líneas de marcadores fluorescentes de Arabidopsis thaliana se desarrollaron fusionando proteínas fluorescentes con genes expresados específicamente en tipos de células diana o mediante el uso de líneas de trampa potenciadoras. Los protoplastos marcados específicos de fluorescencia se clasificaron con éxito en función de la intensidad de fluorescencia y la dispersión directa y las singletas de dispersión lateral.
Las células clasificadas se visualizaron utilizando imágenes de campo claro y fluorescencia. Se muestran los resultados representativos de la biblioteca de secuenciación de ARN de aproximadamente 2, 000 células periciclo del polo del xilema, células primordiales de la raíz lateral, células de endodermis o corteza y células de la tapa lateral de la raíz. Una biblioteca de tamaño pequeño con picos de imprimación o dímero adaptador aún podría secuenciarse después de la selección del tamaño.
Una biblioteca con una distribución de tamaño anormal indicó una preparación de biblioteca fallida. Se analizaron los patrones de expresión génica. Los genes enriquecidos en cualquiera de los cuatro tipos de células de raíz se agruparon y se representaron en un mapa de calor que muestra la especificidad de las expresiones génicas entre diferentes tipos de células.
La alta calidad y pureza de las células diana a través de la correcta activación y clasificación y la prevención de la degradación del ARN son clave para la construcción exitosa de la biblioteca. Para RNA-seq en el modo de célula única, recientemente se han reportado varios métodos integrados con el identificador molecular único que mejoraron significativamente el rendimiento.
