Name: analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
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Este trabajo fue apoyado por una beca de PJ de la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC; conceder ref BB / K018442 / 1.).

1. Crecimiento de las plantas de Arabidopsis y el Tratamiento del estrés <ol><li> Preparar 1 L de Murashige y Skoog (MS) mediante la adición de 4,3 g de MS Basal Sal mezcla, 10 g de sacarosa, 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) a agua desionizada hasta 1 L, y ajustar el pH a 5,7 con hidróxido de potasio (KOH). Añadir 6 g de fitoagar y autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. <ol><li> Antes de la solidificación, se vierte el medio en placas de Petri redondas (diámetro 9 cm, altura 1,5 cm, con 20 a 25 ml de medio MS por placa). Dejar que las placas se sequen durante ~ 1 h en una campana de flujo laminar antes de cerrar los párpados. </li></ol></li><li> Coloque semillas de Arabidopsis thaliana en un tubo de ensayo 1,5 ml para la esterilización de la superficie mediante la adición de 1 ml de etanol al 70% (v / v) que contiene 0,02% (v / v) de Triton X-100 y continua agitación durante 5 a 10 min. Para cada genotipo / condición, se preparan 10 placas de Petri cada uno con ~ 100 - 150 plantas de semillero. </li><li> Espere unos 10 s hasta que las semillas se depositan en elparte inferior del tubo, y luego se descarta el sobrenadante mediante pipeteo. Añadir 1 ml de etanol al 100%, y agitar el tubo de nuevo durante 10 minutos. </li><li> Preparar la campana de flujo laminar, mientras que las semillas están esterilizando. Tome una hoja de papel de filtro por muestra, doblar por la mitad para facilitar la siembra, y sumergirlo en etanol al 100% en la campana. Espere hasta que se seque por completo. Tenga en cuenta que el etanol 100% se utiliza ya que se evapora más rápidamente que 70% de etanol. </li><li> La transferencia de las semillas sobre el papel de filtro con la pipeta 1 ml usando una punta de pipeta de corte ~ 5 mm del extremo fino. Deje que se seque, que debería tener alrededor de 10 - 15 min. </li><li> Sembrar ~ 100 - 150 semillas esterilizadas de manera uniforme sobre cada placa Petri medio MS, y sellar cada placa con cinta quirúrgica. </li><li> Almacenar las placas boca abajo a 4 ° C por 2 - 4 d fomentar y sincronizar la germinación. semillas de edad pueden necesitar permanecer más tiempo (hasta una semana) a 4 ° C. </li><li> La transferencia de las placas a una cámara de cultivo de tejidos vegetales y dejarlos boca arriba.Cultivar las plantas de 8 d bajo un ciclo de día largo (16 h 100 mol · m - 2 · s - 1 luz, 8 h de oscuridad) a 20 ° C. </li><li> Para el tratamiento de estrés, cuando las plantas son 8 d de edad, en la campana de flujo, transferirlos desde el medio de agar, raspando suavemente con la mano con guantes de etanol-esterilizado, en un matraz esterilizado de medio MS líquido que contiene el factor de estrés (por ejemplo, , 200 mM de manitol). Evitar realizar sobre un medio de agar. Cubrir la boca matraz con papel esterilizado y permitir que las plantas para crecer en las mismas condiciones que en el paso 1.8 para una 2 d adicionales en un agitador orbital con agitación suave (~ 100 rpm). </li></ol> 2. Realización de una proteína precursora de Transcripción in vitro / Traducción Nota: Este protocolo supone el uso de Arabidopsis fotosistema I subunidad precursor D (pPsaD) como la plantilla / preproteína, pero el método es compatible con los demás. <ol&gt; <li> Clonar la secuencia codificante (CDS) de pPsaD en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pBluescript II SK (o cualquier otro vector similar con un promotor T7 aguas arriba) 13. Se purifica el plásmido (pBSK-pPsaD) utilizando un kit de aislamiento de ADN y verificar la secuencia mediante secuenciación de ADN. NOTA: Todos estos pasos emplean técnicas de clonación molecular convencionales. </li><li> Determinar la concentración de ADN de plásmido pBSK-pPsaD usando un espectrofotómetro ajustado a medir la absorbancia a 260 nm. Diluir el plásmido a una concentración final de 10 ng / mL. </li><li> Ejecutar un l PCR 20 (para 35 ciclos) usando el plásmido diluido como molde. Preparar la reacción de la siguiente manera: 2 l 10 x tampón de polimerasa, 2 l dNTPs 2 mM, 1 l 5 mM M13 cebador directo (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 l cebador inverso M13 5 mM (5 &#39;-CAG GAA ACA TCG ATG ACC-3&#39;), 1 l diluido pBSK- pPsaD plásmido, 1 U de Taq polimerasa, y agua destilada para obtener el volumen total de reacción hasta20 l. Utilice un programa de PCR estándar, como sigue: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de [95 ° C, 30 seg; 56 ° C, 30 seg; 72 ° C, 30 seg); y 72 ° C, 5 min. </li><li> Ejecutar 5 l de producto de PCR en un 1% (w / v) en gel de agarosa en tampón TAE (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM de ácido acético, EDTA 1 mM) para verificar la amplificación correcta del cDNA, y cuantificar la pertinente banda respecto a los estándares para confirmar la concentración. Guardar el resto del producto a -20 ° C para otras aplicaciones. </li><li> Preparar una reacción de 50 l usando un sistema de reticulocitos de conejo lisado basado libre de células de transcripción / traducción compatible con el ADN de PCR, como sigue: 40 l de lisado de reticulocitos del sistema de transcripción / traducción, 2,5 l radiomarcado [35 S] metionina, 11 Ci / mL (actividad específica:&gt; 1000 Ci / mmol), agua destilada de 2,5 l estéril, y 5 l producto pPsaD PCR (100 - 800 ng). Precaución: Use guantes, ropa de laboratorio y vidrio de seguridadses al manejar material radiactivo. Monitorear y descontaminar la superficie de trabajo y equipo. Disponer de todos los residuos radiactivos en un contenedor de residuos autorizado. </li><li> Incubar la reacción durante 90 min en un baño de agua C 30 °. Detener la reacción mediante la colocación de la muestra en hielo. </li><li> Eliminar 1 l de la reacción en forma de una muestra de ensayo (el mismo volumen también puede servir como un control de entrada para el paso 5.7) para la verificación en la electroforesis estándar dodecil de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de autorradiografía, fluorografía o formación de imágenes de fósforo. Un buen resultado se indica mediante la observación de una banda distinta y fuerte que corresponde al peso molecular de pPsaD (~ 23 kD). Almacenar el resto de la reacción a -80 ° C para otras aplicaciones. </li></ol> 3. Aislamiento de cloroplastos <ol><li> Preparar las siguientes soluciones madre: <ol><li> Preparar el aislamiento de cloroplastos Buffer (CIB, 2x): 0,6 M de sorbitol, cloruro de magnesio 10 mM(MgCl 2), etileno glicol 10 mM tetraacético (EGTA), 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), bicarbonato de sodio 20 mM (NaHCO 3), 40 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) ; ajustar el pH a 8,0 con KOH. Preparar 2 l de 2x CIB, hacer alícuotas y conservarse a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. Para hacer 1x CIB, se diluye la CIB 2x 1: 1 con agua destilada; esto puede ser preparado recientemente en el día del experimento aislamiento cloroplasto. </li><li> Preparar HEPES-MgSO4 tampón Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, 3 mM de sulfato de magnesio (MgSO4), 0,3 M de sorbitol; ajustar el pH a 8,0 con hidróxido de sodio (NaOH). Preparar 400 ml de tampón, hacer alícuotas y conservarse a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li></ol></li><li> Llevar a cabo todos los procedimientos siguientes en el cuarto frío o en hielo. Pre-enfriar todas las soluciones, dispositivos, equipos, y los rotores antes del ptarting. </li><li> Preparar un gradiente de densidad continuo mediante la mezcla de 13 ml de Percoll, 13 ml de tampón 2x ​​CIB, y 5 mg de glutatión en un tubo de centrífuga de 50 ml, y centrifugando la mezcla a 43.000 xg durante 30 min (freno off) a 4 ° C. Después de la centrifugación, el tubo de manejar con cuidado para no perturbar el gradiente y mantener en hielo para su uso posterior. </li><li> Transferir 100 ml de 1x CIB por genotipo / condición a un vaso de 1 litro. <ol><li> Retire las plantas de semillero del medio líquido inclinando ellos en un tamiz, y transferirlos a otro vaso de precipitados que contiene CIB-; a continuación, enjuagar el tejido con el CIB para eliminar cualquier medio líquido residual antes de reemplazarlo con 100 ml de CIB fresco. </li></ol></li><li> Para la homogeneización, utilizar un total de 100 ml de 1x CIB por muestra en cinco rondas consecutivas de homogeneización, cada ronda utilizando 20 ml de CIB frescas presentes en un vaso de 50 ml. <ol><li> Para la primera ronda de la homogeneización, se transfiere el tejido de la planta en el vaso de precipitados 50 ml con la mano, permitiendo que eltampón de retención anterior se escurra entre los dedos. Trate de usar la mayor parte del tejido en la primera ronda, pero asegúrese de que está inmerso con tampón; si esto no es posible, introducir el tejido remanente no utilizado en la segunda ronda. </li></ol></li><li> Coloque la sonda del homogeneizador de tejidos en el tejido y homogeneizar con dos pulsos de 1 - 2 s cada uno. Filtrar el homogenato a través de dos capas de tela de filtración en un ml tubo 250 de la centrifugadora por compresión suave. Conservar el filtrado, y transferir el tejido de nuevo a la 50 ml vaso de precipitados. </li><li> Colocar una segunda alícuota de 20 ml CIB en el vaso de precipitados de 50 ml, añadir cualquier tejido remanente no utilizado en la primera ronda de homogeneización, y repita los pasos de homogeneización y de filtración. Por lo tanto, repita los pasos 3.5 y 3.6 hasta que todo el 100 ml de CIB se ha agotado (es decir, 5 partes alícuotas de 20 ml), y se combinan los filtrados resultantes. </li><li> Centrifugar el homogeneizado agrupado a 1000 × g durante 5 min (freno) a 4 ° C, y se vierte fuerael sobrenadante inmediatamente después de la terminación de la centrifugación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Resuspender el precipitado en el sobrenadante residual que queda en el tubo agitando suavemente el tubo en hielo. No volver a suspender vigorosamente con la pipeta o vortex. </li><li> transferir suavemente el homogeneizado en la parte superior de la gradiente de densidad continuo preparado de antemano, usando una pipeta Pasteur para aplicarlo a través de la pared del tubo de recepción. No perturbar el gradiente. Centrífuga en un rotor oscilante-cubo en 7.800 × g durante 10 minutos (freno desactivado) a 4 ° C. NOTA: Dos bandas verdes se pueden ver en el gradiente después de la centrifugación: la banda inferior contiene cloroplastos intactos, y la banda superior contiene cloroplastos rotos. </li><li> Desechar la banda superior con la pipeta, y luego transferir la banda inferior con una pipeta Pasteur en un tubo de centrífuga de 50 ml fresco, manteniendo un volumen de hasta 8 ml por gradiente. </li><li> Añadir ~ 25 ml de 1x HMS tampón en el tubo e invertir el tubo dos veces to lavar el Percoll de los cloroplastos. Se coloca el tubo de nuevo en el rotor oscilante-cubo y se centrifuga a 1000 × g durante 5 min (freno) a 4 ° C. </li><li> Retirar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el sedimento de cloroplasto en los HMS residual que queda en el tubo agitando suavemente el tubo en hielo. Añadir un adicional de 100 - 300 l de HMS si es necesario (en función del tamaño de la pastilla y el recuento en la Sección 4), pero trata de no diluir la muestra demasiado. <ol><li> Mantenga los cloroplastos en hielo. Cada vez antes de que los cloroplastos se utilizan para aplicaciones posteriores, agitar el tubo para resuspender ellos. Siempre use una punta de pipeta de corte (con un poro ampliada) para transferir los cloroplastos. </li></ol></li></ol> 4. Análisis del rendimiento y integridad de los cloroplastos <ol><li> Añadir 5 l de cloroplastos aislados a 495 l de tampón de 1x HMS en un tubo de 1,5 ml, y después mezclar suavemente invirtiendo el tubo para obtener una dilución 1: 100. </li><li> Place una cubierta de vidrio en la parte superior de la cámara de recuento del hemocitómetro. Lentamente pipeta ~ 40 - 60 l de la suspensión de cloroplastos se diluye en el espacio entre el vidrio de cubierta y la cámara de recuento. Utilizando un microscopio de contraste de fases con un objetivo de 10X o 20X, cloroplastos intactos miran redonda y brillante y están rodeadas por un halo de luz. NOTA: Bajo el microscopio, hay una zona de conteo de 1 mm 2 con 25 cuadrados grandes, cada uno con 16 pequeños cuadrados en el centro de la cámara de recuento. </li><li> Contar el número de cloroplastos en 10 cuadrados grandes. El número de cloroplastos por gran plaza debe ser en promedio entre 10 y 30. Si es demasiado o demasiado pocos cloroplastos están presentes, ajustar el factor de dilución (paso 4.1 anterior) en consecuencia, y repita el procedimiento. </li><li> Calcular el número de cloroplastos por ml (concentración) como sigue: n (el número medio de cloroplastos por gran cuadrado calculado en el paso 4.3) x 25 (número total de cuadrados grandes) × 100 (el factor de dilución) x 10 4 (factor de escala para expresar datos por 1 ml, ya que el volumen por encima de los 25 cuadrados es 0,1 mm 3). </li><li> Calcular el rendimiento real de los cloroplastos multiplicando la concentración por el volumen de la suspensión de cloroplastos obtenido en la etapa 3.12. Normalmente, más de 50 × 10 6 cloroplastos se pueden obtener. </li></ol> 5. cloroplasto importación de proteínas <ol><li> Preparar las siguientes soluciones madre: <ol><li> Preparar tampón 10x HMS: 500 mM de HEPES, 30 mM de MgSO4, y sorbitol 3,0 M; ajustar el pH a 8,0 con NaOH. Preparar 50 ml de este tampón, alícuota y se almacena a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo y a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li><li> Preparar importación tampón de detención: EDTA 50 mM disuelto en tampón 1x HMS. Preparar 50 ml de este tampón, alícuota y se almacena a -20 ° C. </li><li> Preparar 2x tampón de proteína de carga: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) de glicerol, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) de azul de bromofenol. Hacer 50 ml y se almacena a 4 ° C. Justo antes de su uso, añadir 100 l de 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) a 900 l de tampón. </li></ol></li><li> Para ejecutar un transcurso de tiempo de 3 puntos de tiempo, preparar 3 tubos que contienen cada una alícuota de 130 l de tampón de parada de importación, y dejarlos en el hielo. Preparar una reacción de importación de 450 l en un tubo de 2 ml (por genotipo / condición). Descongelar todos los ingredientes justo antes del uso. <ol><li> Por una reacción de importación, por lo general utilizar 10 × 10 6 cloroplastos en un volumen l; por ejemplo, si la concentración del cloroplasto es 2,5 × 10 8 / ml, utilizar 40 l de suspensión de cloroplastos. Tres puntos de tiempo necesitarán 3 × A l (es decir, 120 l en nuestro ejemplo). </li><li> Mezclar los componentes de las reacciones en hielo en el siguiente orden: agua destilada (para hacer el volumen total de 600 l), tampón B l 10x HMS (donde B = [600-3 × A] / 10; es decir, 48 en nuestro ejemplo), 12 lÁcido 1 M glucónico (sal de potasio), 6 l 1 M NaHCO 3, 6 l 20% (w / v) de BSA, 30 l de adenosina 100 mM 5&#39;-trifosfato de sal de magnesio (MgATP), 24 l de metionina 250 mM (no radiomarcado ), y 30 l precursor de la proteína. Inmediatamente antes de iniciar la reacción de importación, añadir 3 × A l de cloroplastos y mezcle golpeando suavemente el tubo. </li></ol></li><li> Incubar el tubo de reacción a 25 ° C en un baño de agua a 100 mol · m - 2 · s - 1 luz. De vez en cuando chasquear los tubos para volver a suspender los cloroplastos. </li><li> Para llevar a cabo un transcurso de tiempo, retirar 130 alícuotas de la reacción en los puntos de tiempo requeridos dentro del rango lineal de importación, que para pPsaD es hasta ~ 12 min (4, 8 y 12 min puntos temporales son adecuados en este caso). El período de intervalo lineal puede variar para diferentes proteínas 14. Por lo tanto, se sugiere para probar cada preproteína individual antes para optimizar tSeñala tiempo. </li><li> Inmediatamente después de la retirada, traslado cada alícuota de 130 l a un tubo de tampón de detención importación enfriado con hielo, mezclar golpeando suavemente el tubo y retener todos los tubos en hielo hasta que el tiempo de curso se ha completado. </li><li> Centrifugar las muestras durante 30 s a 12.000 xg en una microcentrífuga, desechar el sobrenadante con la pipeta, y volver a suspender las bolitas en 15 l de 2x tampón de carga de proteínas mediante agitación. </li><li> Analizar todas las muestras y además el control de entrada pPsaD (que contiene pPsaD equivalente al 10% de la cantidad añadida a cada reacción de importación, desde el paso 2.7) por la norma SDS-PAGE y autorradiografía, fluorografía o formación de imágenes de fósforo 15. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar y analizar los resultados. Para proporcionar una indicación de la eficiencia de importación, la cantidad de proteína importada en diferentes genotipos / condiciones se puede evaluar mediante la medición de la radiactividad asociada con cada banda madura. </li></ol>

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Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Recientemente, hemos mostrado que cloroplasto importación de proteínas se puede regular de forma activa por el estrés, que es fundamental para la función del cloroplasto y la planta de la supervivencia 3. En ese estudio, para controlar dicha regulación, modificamos nuestro aislamiento de cloroplastos y en los procedimientos de ensayo in vitro de importación con el fin de permitir la evaluación de la capacidad de importación de plantas cultivadas bajo condiciones de estrés. Los resultados indicaron un papel importante en la regulación de SP1 importación de proteínas del cloroplasto. Convencionales en ensayos in vitro de importación utilizan plantas cultivadas en MS estándar medio de agar 6,17,18. En el caso del mutante sp1 se describe aquí, tales ensayos convencionales no revelaron diferencias en la proteína de importación en relación con el WT 3. Sin embargo, el papel de SP1 en la regulación de la importación de proteínas se revela claramente cuando la importación de proteínas se evaluó en condiciones de estrés utilizando los métodos descritos en el presente documento (Figura 1). Si bien may no sea posible comparar directamente los datos de importación a partir del ensayo condiciones de estrés con los obtenidos a partir de ensayos convencionales (como los métodos emplean las plantas que crecen en cultivo líquido y en medio de agar, respectivamente), las comparaciones entre las condiciones de estrés y no estrés son viables siempre y cuando las plantas son adultos en el mismo medio de cultivo líquido, con o sin factores de estrés. En comparación con el tratamiento de estrés en un medio de agar, un cultivo líquido es más conveniente para el tratamiento de la gran cantidad de plantas necesarias para los ensayos de importación en vitro. Además, facilita la aplicación uniforme del factor estresante a todas las plantas, que es particularmente importante para los tratamientos de estrés a corto plazo. El método que aquí se presenta se ha aplicado para estudiar el estrés osmótico mediante tratamiento manitol, pero podría ser fácilmente adaptado a una amplia gama de otros tipos de estrés; por ejemplo, estrés salino a corto plazo y el estrés oxidativo, para el que los factores de estrés correspondientes podrían be aplicado de manera similar a través de un medio MS líquido. Para otros tipos de estrés, se sugiere el grado de estrés se ha optimizado primera; excesivamente severos tratamientos pueden tener efectos adversos sobre el rendimiento y / o la competencia de importaciones de los orgánulos aislados. Hay varios pasos importantes dentro del protocolo al que se debe prestar especial atención, como se detalla a continuación. La concentración de agar óptima para el medio MS puede diferir (0,6 hasta 0,9%, w / v) según el fabricante. Por lo tanto, se recomienda para optimizar empíricamente la concentración de agar antes de comenzar los experimentos. El medio no debe ser tan blandos que se pega al tejido en la etapa de recolección (paso 1.9), tampoco debe ser tan fuerte que inhibe el desarrollo radicular de la planta. La concentración de sacarosa también se puede ajustar de acuerdo con las plantas utilizadas. Cuando se trabaja con mutantes particularmente enfermos, medio MS suplementado con 2 - 3% (w / v) de sacarosa puede ayudar a las plantas a crecer mejor. cuando la aplicaciónmentira tratamientos de estrés, que no es bueno para transferir las plantas muy antiguas al medio líquido (por ejemplo,&gt; 14 días de edad). Esto se debe a las raíces más desarrolladas de las plantas más viejas son más fácilmente dañadas durante la transferencia. Con respecto al sistema de transcripción / traducción, hay 2 sistemas principales: los basados ​​en germen de trigo, y los basados ​​en reticulocitos de conejo. Estos kits pueden utilizar diferentes plantillas, tales como plásmidos linealizados, plásmidos no linealizada, o productos de la PCR. Los kits también son específicos para los promotores T3, T7, y SP6. Tenga en cuenta que el kit se recomienda aquí sólo es adecuado para su uso con productos de PCR y el promotor T7. Sin embargo, por razones desconocidas, algunos preproteínas radiomarcados hechas con este sistema podrían no funcionar de manera eficiente en el ensayo de importación; en tales casos, se puede considerar probar un sistema de extracto de germen de trigo o de un sistema de lisado de reticulocitos significado para plantillas de plásmidos. También se puede mejorar el resultado de la transcripción / traducción reacción mediante la modificación de las condiciones de reacción de acuerdo con el manual del fabricante. Es importante comenzar el aislamiento de cloroplastos temprano en la mañana (o temprano en el ciclo de luz de la cámara de crecimiento) con el fin de evitar la acumulación de almidón en el interior de los cloroplastos debido a la fotosíntesis, lo que puede dificultar el aislamiento de orgánulos intactos. El procedimiento de aislamiento del cloroplasto tiene que hacerse rápidamente y sin retrasos innecesarios, y los cloroplastos aislados siempre se debe mantener frío. Esto es para mitigar la observación de que los cloroplastos aislados perderá gradualmente su viabilidad, que no es bueno. Si se utiliza CIB recién descongelado o tampón HMS, asegúrese de mezclar el tampón antes de usar para obtener una solución homogénea. Las condiciones óptimas para la homogeneización del material vegetal se han establecido empíricamente, y se puede variar si se utiliza un homogeneizador de tejidos diferente. Si los diferentes genotipos de plantas contienen similalos niveles de clorofila r, la cuantificación de la clorofila se pueden usar como una forma alternativa para normalizar las muestras antes de la realización de los ensayos de importación. La clorofila se puede determinar espectrofotométricamente después de la extracción de una muestra de los cloroplastos aislados en 80% (v / v) de acetona acuosa 19,20. Sin embargo, si las tasas de importación de plantas con diferentes contenidos de clorofila (por ejemplo, los mutantes con fenotipos cloróticas) se van a comparar, contando para normalizar las muestras de cloroplastos en los ensayos de importación utilizar el número de cloroplastos. Es particularmente importante para volver a suspender los cloroplastos a fondo en el paso 3,11. resuspensión es insuficiente, puede dejar agregados de los cloroplastos, lo que hará que sea difícil para contar los números con precisión y por lo tanto va a dificultar la correcta carga en las reacciones de importación. Si la agregación severa se observa bajo el microscopio (por ejemplo, agregados con&gt; 10 cloroplasto unidas entre sí), continuar agitando la muestra del cloroplasto en hielo hasta el aggregatES se eliminan. Es más fácil para volver a suspender los cloroplastos en un volumen más pequeño de tampón. Es importante ser consciente de que las reacciones de importación de proteínas (Sección 5) deben llevarse a cabo con las debidas precauciones, debido a su naturaleza radiactiva. precauciones necesarias incluyen: el uso de guantes desechables, ropa de laboratorio y gafas de seguridad, el control y la descontaminación de la superficie de trabajo y equipo, y la eliminación de todos los residuos radiactivos en un contenedor de residuos autorizado. También hay que tener en cuenta que la presión osmótica correcta es fundamental para mantener la integridad de los cloroplastos durante las reacciones de importación, y esto se mantiene principalmente por la memoria intermedia de HMS. Debido a 10x HMS es viscoso, primero se debe calentar hasta la temperatura ambiente, y después se mezcla a fondo, y se aplica utilizando una punta de pipeta de corte para garantizar una medición de volúmenes precisos. En la reacción de importación, se añade metionina fría para inhibir la incorporación de metionina radiomarcada libre en relación chloroplproteínas ast través de la traducción organellar durante la etapa de incubación, mientras que BSA se utiliza para minimizar la proteólisis, actuando como un sustrato para proteasas.

Los cloroplastos son muy abundantes orgánulos que existen en los tejidos verdes de las plantas. Son bien conocidos por su papel fundamental en la fotosíntesis, un proceso que utiliza energía de la luz para convertir el dióxido de carbono de azúcar y contribuir así a casi toda la vida en la tierra 1. Además, los cloroplastos (y la familia más amplia de orgánulos relacionados llamados plástidos) desempeñan muchas otras funciones vitales en plantas, incluyendo la biosíntesis de aminoácidos, lípidos, pigmentos, y la detección de las señales ambientales tales como la gravedad y el desafío patógeno. La fotosíntesis genera especies reactivas del oxígeno (ROS) como subproductos, que en ciertas circunstancias tienen una función muy útil, pero si produce en exceso puede causar efectos perjudiciales o incluso letales. La sobreproducción de ROS está particularmente promovido por condiciones ambientales adversas, y por lo tanto los cloroplastos están estrechamente relacionadas con las respuestas al estrés abiótico, tales como la salinidad y estrés osmótico 2. chloroplasts tienen una estructura compleja. Cada cloroplasto está rodeado por una capa exterior de doble membrana llamada el sobre, que consta de membranas exterior e interior. Internamente, hay otro sistema de membrana llamada los tilacoides, donde las reacciones luminosas de la fotosíntesis tienen lugar. Entre los dos sistemas de membrana hay una llamada compartimento acuoso el estroma, que está implicado en la fijación de carbono. Un cloroplasto puede contener un máximo de ~ 3.000 proteínas diferentes, y la gran mayoría de estas proteínas se sintetizan en el citosol en forma de precursor y necesitan ser importados en el orgánulo través translocons proteínas dedicados en las membranas de la envoltura 1. Curiosamente, trabajos recientes han indicado que la importación de proteínas del cloroplasto se regula de forma activa, y por lo tanto es capaz de ejercer un importante nivel de control sobre el proteoma del cloroplasto. Por ejemplo, se informó en 2015 de que la importación de proteínas puede responder al estrés abiótico a través de la regulación directa de la abundancia de THe translocon en la membrana envolvente exterior de los cloroplastos (TOC) por el sistema ubiquitina-proteasoma 3. El uso de los cloroplastos y purificados sintetizados in vitro proteínas precursoras, la importación de proteínas puede ser reconstituido in vitro 4,5. Por lo tanto, los métodos in vitro pueden utilizarse para evaluar las tasas de importación en las diferentes plantas mutantes 6, que ha sido un enfoque crítico para el análisis de componentes putativos de la maquinaria de importación de proteínas y para descubrir los mecanismos que subyacen a la importación de proteínas y su regulación. Además, los cloroplastos pueden ser procesados con un fraccionamiento adicional o la digestión de la proteasa, después de la importación in vitro, lo que puede facilitar estudios sobre la localización sub-organoides y la topología de proteínas de cloroplastos 7,8. Para el estudio de la regulación de la importación de proteínas por el estrés, hemos modificado nuestro método de aislamiento de cloroplastos rutina como describiremosaquí. Es importante destacar que los cloroplastos se aislaron de plantas que habían sido cultivados en el estándar de Murashige y Skoog (MS) medio de agar durante 8 días y luego transferidas a un medio MS líquido suplementado con factor de estrés, proporcionando un tratamiento de estrés relativamente corto controlada. El rendimiento y la competencia de los cloroplastos aislados de tales plantas tratadas por estrés son compatibles con el de aguas abajo en un ensayo de importación de proteínas in vitro 3. Además del protocolo de aislamiento de cloroplastos, presentamos nuestro método de rutina para la importación de proteínas in vitro, lo cual ha demostrado ser robusta y es ampliamente utilizado 3,9-12.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog basal salt&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>surgical tape (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>filtration cloth (Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL centrifuge bottle</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probe (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 250&amp;nbsp;mL bottles (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 50&amp;nbsp;mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radiolabeled [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>phase-contrast microscope (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0.1 mm depth, 1/400 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>cover glasses</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &amp;times; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL microfuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microfuge tubes</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid (potassium salt)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>methionine</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>unavailable</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants

Los cloroplastos son orgánulos con muchas funciones vitales en las plantas, que incluyen no sólo la fotosíntesis, pero otras numerosas funciones metabólicas y de señalización. Por otra parte, los cloroplastos son críticos para la respuesta de las plantas a diferentes estreses abióticos, tales como la salinidad y estrés osmótico. A cloroplasto puede contener hasta ~ 3.000 diferentes proteínas, algunas de las cuales son codificadas por su propio genoma. Sin embargo, la mayoría de las proteínas del cloroplasto están codificados en el núcleo y se sintetiza en el citosol, y estas proteínas necesitan ser importados en el cloroplasto través translocons en las membranas de la envoltura del cloroplasto. Estudios recientes han demostrado que la importación de proteínas de cloroplastos puede ser regulada de forma activa por el estrés. Para investigar bioquímicamente como la regulación de la importación de proteínas en condiciones de esfuerzo, hemos desarrollado el método descrito aquí como un procedimiento rápido y sencillo que se puede conseguir fácilmente en cualquier laboratorio. En este método, las plantas se cultivan en conditio normalesns y luego se exponen a condiciones de estrés en cultivo líquido. El material vegetal se recoge, y los cloroplastos son luego liberados por homogeneización. El homogenado crudo se separa por centrifugación en gradiente de densidad, lo que permite el aislamiento de los cloroplastos intactos. rendimiento del cloroplasto se evalúa mediante recuento, y la integridad del cloroplasto se examina bajo un microscopio. Para los ensayos de importación de proteínas, cloroplastos purificados se incubaron con 35 S radiomarcado in vitro traducido proteínas precursoras, y los experimentos de tiempo-por supuesto se llevan a cabo para permitir comparaciones de las tasas de importación entre los genotipos bajo condiciones de estrés. Se presentan los datos generados usando este método, que muestran que la tasa de importación de proteínas a los cloroplastos de un mutante regulador se altera específicamente en condiciones de estrés osmótico.

Un ejemplo de proteína del cloroplasto experimento de importación con 3 puntos de tiempo se muestra en la Figura 1. PSAD es un componente ~ 18 kD del fotosistema I expuesto al estroma, con una forma precursora de ~ 23 kD 16. Psad fue seleccionado aquí para el ensayo de importación de proteínas in vitro debido a que sus niveles de estado estacionario se encuentra elevado en el mutante SP1, en relación con WT, bajo condiciones de estrés, lo que sugiere un cambio en la eficiencia de las importaciones en el mutante 3. El mutante sp1 lleva un defecto en un importante regulador de la maquinaria de importación del cloroplasto proteína - la proteína SP1 3. Para cloroplastos aislados de plantas cultivadas en condiciones normales, no había diferencia evidente en la importación pSAD entre sp1 y WT (datos no mostrados) 3. Sin embargo, usando los métodos descritos aquí para evaluar la importación pSAD en cloroplastos aislados de osmóticamenteplantas estresadas, se detectó una diferencia clara. Si bien se observó la acumulación de la forma de proteína madura de una manera dependiente del tiempo con ambos genotipos, la tasa de importación fue significativamente menor para los cloroplastos WT que para los cloroplastos SP1 (Figura 1), lo cual es consistente con nuestros resultados previos 3, y revela un papel importante para la proteína SP1 en la regulación de la importación del cloroplasto de pSAD bajo condiciones de estrés. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Figura 1. Una proteína de importación efectuadas mediante el uso del ensayo Los cloroplastos aislados de las plantas que crecen bajo condiciones de estrés osmótico. Los cloroplastos se aislaron de un WT 10 días de edad (Col-0) y unos mutantes de Arabidopsis SP1 plantas cultivadas bajo condiciones de estrés (manitol 200 mM) durante 2 d. Importación (A) de proteínas se llevó a cabo utilizando [35 S] Methionine marcado pPsaD y se deja proceder durante 4, 8 y 12 min antes del análisis por SDS-PAGE y formación de imágenes de fósforo. Se analizó en paralelo, el control de entrada 10% pPsaD comprende traducido in vitro de proteínas (IVT). El precursor (pre) y maduro (mat) formas de pPsaD se indican, mientras que en el medio hay dos bandas que probablemente corresponden a productos de traducción truncadas o proteolizada porque su intensidad no cambió durante el transcurso de tiempo (*). (B) Para comparar las tasas de importación en los cloroplastos de las plantas WT y SP1 cultivadas bajo condiciones de estrés, se cuantificó la intensidad de cada banda correspondiente a la proteína madura importada en A. Todos los datos se expresan como porcentaje de la cantidad de proteína importada en los cloroplastos de las plantas WT después de 12 minutos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de plantas estresadas | Biología | Video

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Aquí se describe un nuevo método para estudiar la importación de proteínas en cloroplastos aislados bajo estrés. El método es rápido y sencillo, y se puede aplicar para estudiar las consecuencias de diferentes condiciones de estrés para la importación de proteínas de cloroplastos, y los mecanismos de regulación correspondientes.

Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

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21.0K vistas.  University of Oxford.  Aquí se describe un nuevo método para estudiar la importación de proteínas en cloroplastos aislados bajo estrés. El método es rápido y sencillo, y se puede aplicar para estudiar las consecuencias de diferentes condiciones de estrés para la importación de proteínas de cloroplastos, y los mecanismos de regulación correspondientes. 

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Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Investigación

Bioquímica

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Biología

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

<meta charset="utf8"></head><body>Análisis de la regulación traslacional en Arabidopsis sometida a estrés térmico

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational activities of various genes can help us understand the molecular mechanisms underlying plant resilience, contributing to the development of crops with enhanced stress tolerance in the face of global climate change. This paper presents a detailed methodology for assessing translation efficiency through polysome profiling in plants exposed to heat stress. The procedure is divided into three parts: heat stress treatment for Arabidopsis, translation efficiency test using polysome profiles, and calculation of translation efficiency by isolating non-polysomal and polysomal RNA based on the profile. In the first part, Arabidopsis plants are subjected to controlled heat stress conditions to mimic environmental challenges. The treatment involves exposing the plants to high temperatures for specified durations, ensuring consistent and reproducible stress induction. This step is crucial for studying the plant's physiological and molecular responses to heat stress. The second part involves the translation efficiency test using polysome profiling. Polysomes are extracted through sucrose gradient centrifugation, which separates mRNAs based on ribosomal loading. This allows for the examination of ribosome occupancy on mRNAs, providing insights into the translational control mechanisms under stress conditions. In the third part, RNA is isolated from both polysomal and non-polysomal fractions. Spike-in RNA is used to accurately measure the amount of RNA in each fraction. The calculation of translation efficiency is performed by comparing the distribution of mRNAs across these fractions under normal and heat stress conditions. The translation activities of specific genes are further assessed by performing quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with ribosome-associated RNA and total RNA. This methodology focuses exclusively on the effects of heat stress, providing a detailed protocol for analyzing translational regulation in plants.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Protocolo de perfil de polisomas para estudiar la regulación traslacional en Arabidopsis bajo estrés térmico

The protocol presented here involves polysomal profiling to isolate translatome, mRNAs associated with ribosomes, into non-polysomal and polysomal RNAs from Arabidopsis through sucrose density gradient centrifugation. This method demonstrates the translation efficiency of heat-stressed Arabidopsis.

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

Protein Transport to the Thylakoids

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron transport proteins and is enclosed by a thylakoid membrane rich in the light-harvesting complex. Proteins targeted to the thylakoids are transported as precursors and are sorted by the general TOC/TIC import pathway. Once the precursor reaches the stroma, stromal processing peptidases remove their transit signal and expose thylakoid signal sequences. The processed precursors use distinct mechanisms to reach the thylakoid lumen or membrane.
The first mechanism is the chloroplast signal recognition particle or cpSRP-dependent pathway that transports chlorophyll-binding proteins to the thylakoid membrane using energy from GTP hydrolysis. cpSRP proteins and FtsY receptors bind the processed precursor and stimulate GTP hydrolysis. The energy derived facilitates precursor entry through the Alb3 translocase and their subsequent insertion into the thylakoid membranes. In a second mechanism, small thylakoid membrane proteins form soluble stromal intermediates with short hydrophobic signal-like peptides that allow these proteins to fold and insert into the membrane. Once inserted, the signal-like peptides are cleaved by thylakoid processing peptidases to form the mature transmembrane protein. A third pathway employs Oxa-like integrases for inserting thylakoid membrane protein spontaneously without any energy input or targeting factors.
Some proteins targeted to the lumen employ the chloroplast secretory or cpSec pathway, which transports unfolded proteins across the thylakoid membrane. Processed precursors carrying a twin-arginine or RR motif in the N terminal domain often get folded by the stromal chaperonin Cpn60. Folded peptides are then translocated to the thylakoid lumen by the chloroplast twin-arginine or cpTat pathway. cpTat peptidases possess a basic amino acid in their C-terminal domain that helps distinguish and avoid cpSec precursors and cleaves cpTat precursors only.

Transporte de proteínas a los tilacoides

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron ...

Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

Resumen

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Capítulos en este video

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados en

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Transporte de proteínas a los tilacoides

Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

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Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

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Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

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Transporte de proteínas a los tilacoides

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