Hello.Today vamos a mostrarles un protocolo que protoplasta millones de células de mesófilo de maíz y las transforma con alta eficiencia. Los pasos principales del protocolo son primero digerir y eliminar la pared celular de la planta, liberando los protoplastos, y luego transformar el protoplasto usando PEG. La gran diferencia entre este protocolo y otros es la escala de transformación.
La mayoría de los protocolos terminan con entre 1.000 y 10.000 protoplastos transformados. Sin embargo, nuestro protocolo proporciona millones de protoplastos de maíz transformado. Aquí tenemos plántulas de maíz cultivadas en la oscuridad durante nueve a 11 días después de la germinación.
Corte las plántulas justo por encima del nivel del suelo y colóquelas en agua. Mantenga las plantas en la oscuridad cuando no estén en uso. Seleccione la segunda y tercera hoja de cada plántula, teniendo cuidado de excluir hojas con áreas marrones o dañadas.
Seleccione de 12 a 16 hojas y corte un centímetro de las puntas. Luego corte una sección de 10 centímetros de cada hoja. Apile las secciones de hojas una encima de la otra con los extremos basales juntos.
Sujete el haz en el extremo basal con un clip aglutinante. Coloque el haz de hojas en un pedazo de papel blanco. Corte rodajas de hojas de 0.5 a un milímetro de ancho.
Es importante cortar rodajas finas y consistentes. Después de cortar parte del haz de hojas, transfiera las rodajas a la solución enzimática. No permita que el material se seque.
Agite suavemente la solución enzimática para humedecer el material. Coloque papel de aluminio sobre el vaso de precipitados para bloquear la luz. Repita este proceso hasta que todo el paquete se corte cerca del clip de carpeta.
Después de cortar, la solución debería verse así. Transfiera el vaso de precipitados de la solución enzimática a un frasco de campana. Infiltrar al vacío durante tres minutos a temperatura ambiente.
Incubar en una coctelera de mesa a 40 RPM a temperatura ambiente durante dos horas y media. Después de la incubación, remolino a la solución. Debe verse lechoso, lo que indica una digestión exitosa.
Incubar en el agitador de mesa a 80 RPM a temperatura ambiente durante 10 minutos más. Coloque el vaso de precipitados con solución enzimática sobre hielo. Detenga la digestión agregando un volumen de MMG helado.
Filtrar a través de un filtro de células de 40 micras en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Dividir la solución en alícuotas de no más de 10 mililitros cada una. Verter en tubos de vidrio de fondo redondo refrigerados.
Centrifugar los tubos a 100 G durante cuatro minutos. Retire el sobrenadante, asegurándose de no perturbar el pellet. Vuelva a suspender, luego agrupe las muestras para lavados posteriores.
Lave los protoplastos dos veces con cinco mililitros de MMG. Gira hacia abajo cada vez a 100 G durante tres minutos. El pellet debe ser de un hermoso color verde amarillo brillante.
Podrás resuspender el pellet girando suavemente el tubo. Resuspender en un mililitro de MMG, y diluir una pequeña alícuota 10 a 20x para contar. Es importante resuspender bien antes de aliqouting, ya que los protoplastos se asentarán rápidamente.
Cargue los protoplastos diluidos en el hemocitómetro. Cuente los protoplastos bajo un microscopio óptico. Una buena preparación no tendrá mucho exceso de residuos flotando después del lavado.
Los buenos protoplastos son circulares con plastidios visibles. Utilice el recuento de celdas para calcular el número total. Esta preparación resultó en poco más de 10 millones de protoplastos.
Recomendamos comprobar la viabilidad con colorante de diacetato de fluoresceína. Los aislamientos exitosos de protoplastos producen una viabilidad entre 70 y 90%Mezcle los protoplastos con su plásmido de interés. Este ejemplo utiliza 1 millón de protoplastos y 15 microgramos de ADN.
Incubar en hielo durante 30 minutos. Vuelva a suspender golpeando el costado del tubo. Agregue la solución de PEG para alcanzar una concentración final de 12% PEG.
Mezclar suavemente invirtiendo varias veces. Los protoplastos y la solución de PEG son frágiles, así que no agite el tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Diluir con cinco volúmenes de solución de incubación y mezclar suavemente por inversión. Centrifugar los tubos a 100 G durante cuatro minutos. Lavar una vez con un tampón de incubación de un mililitro.
Tenga cuidado de no molestar el pellet. Girar a 100 G durante tres minutos. Resuspender en tampón de incubación a una concentración de 500 a 1000 células por microlitro.
Incubar en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, gire hacia abajo a 100 G durante cuatro minutos. Lavar dos veces con solución de incubación refrigerada.
Girar cada vez durante tres minutos a 100 g a temperatura ambiente. Vuelva a suspender, luego cargue una pequeña alícuota en el hemocitómetro para la verificación final. Primero, cuente el número total de protoplastos bajo campo claro.
Ahora, observe la fracción de protoplastos que fluorescen bajo UV para verificar la transfección. Los protoplastos están expresando nuestro reportero de GFP. Ahora, obtengamos algunas métricas sobre la eficiencia de la transfección.
En esta preparación, obtuvimos 10 millones de protoplastos totales, de los cuales transfectamos 1 millón. Al día siguiente, recuperamos 335.000. De ellos, tuvimos una tasa de transformación del 30,3%Esto nos deja con nuestro total de alrededor de 100.000 protoplastos que expresan GFP.
La eficiencia de la transfección puede variar. Como puede ver en el gráfico, habitualmente vemos eficiencias entre el 20 y el 50% entre las preparaciones repetidas. Este protocolo permite la recolección y transformación de millones de protoplastos de mesófilos de maíz.
Una de las mejores partes del protocolo es su capacidad para escalar. Al escalar la cantidad de volumen, así como el número de protoplastos utilizados en la transformación, puede aumentar su transformación en más del orden de magnitud de lo que hemos mostrado hoy. Hasta la fecha, nuestro experimento de tubo único más grande comenzó con 20 millones de protoplastos y 200 microgramos de ADN, y terminó con 3,1 millones de protoplastos transformados al día siguiente.
Este protocolo de alto rendimiento es especialmente útil cuando se necesitan probar muchas construcciones de plásmidos diferentes, pero los colaboradores han utilizado este protocolo para fines que no requieren la capacidad de escalar, como el diseño de circuitos genéticos sintéticos y maíz. Gracias por ver nuestro video. Esperamos que haya ayudado.
