Este trabajo fue apoyado por el contrato de EE.UU. Defense Advanced Research Projects Agency N66001-12-C-4039 a YS, una beca de la Fundación Alfred P. Sloan para RSL, y los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 R21 CA130266 HG003224 y fue a FPRFPR también con el apoyo de una beca del Instituto Canadiense para la Investigación Avanzada y por la excelencia Canada Research Chairs programa.

1. Generación de ProMonsters <ol><li> Preparar el casete GFP reemplazo universal mediante la amplificación de un tetO 2-GFP marcador y el marcador URA3 a partir del plásmido pYOGM012 (resistencia a ampicilina) usando cebadores con secuencias: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG y GTACCGGGTAATAACTGATATAAT GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC (regiones en negrita proporcionar homología con las regiones flanqueantes de la casete KanMX4 permite la sustitución específica). La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa Phusion, tampón de HF, y 3% de sulfóxido de dimetilo (New England BioLabs) a partir de la concentración de plantilla de ADN de 0,5 ng / l. El programa de PCR es de 98 ° C durante 30 segundos y 35 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 49 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 1,5 min. El volumen de reacción debe ser&gt; 50 l para proporcionar suficiente ADN para cada experimento de transformación. Nosotros purificamosel producto usando un QIAquick PCR kit de purificación (Qiagen) con ~ 50 l de la reacción de PCR procesado por columna, pero omitiendo la etapa de purificación puede aumentar el rendimiento de los transformantes. Alternativamente, liberar un fragmento que contiene el tetO 2-GFP y URA3 marcadores, así como las regiones homólogas para KanMX4 focalización, por digestión del plásmido pYOGM057 (resistencia a ampicilina) usando la enzima de restricción EcoRI (New England Biolabs). La concentración de ADN en esta reacción debe ser ~ 30 ng / ul. El volumen de reacción debe ser&gt; 34 l. Para la integración de la casete de GFP en una región que no sea KanMX4, ajuste la región de homología de los cebadores de PCR indicados a los correspondientes secuencias homólogas. </li><li> Transformar una cepa haploide-una de la colección de levadura knockout KanMX4 12 con la casete de GFP supresión universal. Siguiendo el protocolo por Woods y Gietz 13 0,34 l de laMuestra de ADN (producto de PCR purificado o restricción no purificado digest) se debe utilizar para cada experimento de transformación. Placa quinto de la mezcla de transformación uno sobre una placa de CAA-Ura (0,67% de base nitrogenada de levadura, 2% de glucosa, 0,6% de ácido casamino, 0,0025% hemisulfato de adenina, 0,005% de triptófano, y 2% de agar). </li><li> Streak los transformantes en un fresco CAA-Ura placa para obtener colonias aisladas. </li><li> Transferir las células de una colonia en una placa de YPDA contenía 200 mg / ml de G418 para confirmar la falta de crecimiento. Para confirmar la integración de las buenas prácticas agrarias con éxito, siga los pasos (1,5) - (1,9) para realizar la PCR de colonias. </li><li> Añadir las células tomadas de una colonia en 2 l de tampón de lisis (0,1 M de fosfato sódico, pH 7,4, 1 unidad de zimoliasa ZymoResearch) en un tubo de 0,2-ml PCR o un pocillo de una placa de 96 pocillos. Mezclar pipeteando la solución dentro y fuera de una punta de pipeta. </li><li> Superposición con una gota (aproximadamente 20 l) de aceite mineral con un Pipetman P200 (Gilson). </li><li> Incubar la mezcla a 37 °C durante 20 min y después a 95 º C durante 10 min. </li><li> Diluir el lisado con 50 l de agua. Mezclar pipeteando la solución dentro y fuera diez veces. </li><li> Analizar 1 l de lisado utilizando el 10-mu l reacciones de PCR con (A) un cebador directo que hibrida con la región aguas arriba de acompañamiento emparejado con un cebador de la secuencia CCTGAGAAAGCAACCTGACC (285 pb desde el comienzo de la cassette), (B) un inverso cebador que hibrida con la región aguas abajo junto con un cebador de la secuencia GCATTGGGTCAACAGTATAG (375 pb desde el extremo), (C) dos cebadores que se reasocian a KanMX4 con las secuencias CGTACTCCTGATGATGCATG y GACGAAATACGCGATCGCTG (181 pb), y (d) dos cebadores que hibridar con la secuencia de tipo salvaje del gen diana (Figura 4). (D) es importante porque aproximadamente el 8% de las cepas en las colecciones de deleción se sabe que contienen aneuploidía 14. Un transformante correcta debe ser positiva con (A) y con (B), y negativa (C) y (D). </li><li> Para introducir unGMToolkit en el transformante, añadir aproximadamente 250.000 células de la cepa transformada y 250.000 células de cualquiera de RY0146 (que contiene GMToolkit-a) o RY0148 (que contiene GMToolkit-α) en un tubo de 1,6 ml Eppendorf. Vortex. Los genotipos de RY0146 y RY0148 son MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-His5] y MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2], respectivamente. pr denota promotor. El número de células debe ser estimada a partir de la densidad óptica del cultivo precedente. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 2 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para permitir el intercambio de aire, hacer un agujero en la tapa usando una chincheta se trató con 70% de etanol. </li><li> Añadir 50 l de medio YPDA (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa, y 0,003% hemisulfat adeninae). Vortex. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 5 min. </li><li> Colocar el tubo en una caja húmeda. Esto puede ser creado con una caja de punta vacío, un soporte de punta pequeña, y una toalla de papel húmeda. </li><li> Incubar la caja durante la noche a 30 ° C. </li><li> Seleccione diploides se aparearon por primera en estrías, las células en una placa CAA-Ura. Incubar la placa a 30 ° C durante un día. </li><li> Tomando las células de la zona de mayor racha, a cabo para asegurarse colonias aisladas en placas de YPDA (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa, 0,003% hemisulfato de adenina, y 2% de agar) que contenían 200 ug / ml de G418 para la selección de diploides que contiene una o GMToolkit-100 ug / ml nourseotricina (Nat) 15 para la selección de diploides contienen GMToolkit-α. </li><li> Incubar la placa a 30 ° C durante 3 días. </li><li> A partir de una colonia aislada, transferir la mayor parte de las células a 500 l de medio de agar sin GNA (1% extracto de levadura, 3% de caldo nutriente Difco, y 5% de glucosa, la glucosa autoclave y el resto de tque los componentes por separado como 2 × soluciones para evitar la caramelización) en un tubo de cultivo de 5-ml con la tapa aflojada. </li><li> Gire el tubo horizontalmente durante cinco horas a 30 ° C. El eje de la rotación debe ser paralelo al eje longitudinal del tubo. </li><li> Confirmar que las colonias utilizadas en (1,21) son Ura + estriando a cabo en una placa CAA-Ura. </li><li> Centrifugar el tubo a 800 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 500 ul de medio de esporulación mínima (1% de acetato de potasio, 0,005% de acetato de zinc; filtro a esterilizar). Vortex. </li><li> Centrifugar el tubo a 800 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Repetir (1,25) - (1,26) dos veces. </li><li> Añadir 1 ml de medio de esporulación mínimo suplementado con 7,5 mg / ml de lisina, 7,5 mg / ml de leucina, 5 mg / ml de histidina, 5 mg / ml de metionina, y 1,25 g / ml uracilo (para mejorar la tasa de esporulación de las cepas auxotróficas) . Vortex. </li><li> Girar el tubo a temperatura ambiente durante un día. </li><li> Girar el tubo a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Centrifugar 125 l de esta mezcla en un tubo de 1,6 ml Eppendorf-a 800 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 50 l de solución de zimoliasa (100 mM tampón fosfato de sodio, pH 7,4, 1 M sorbitol, y 2 unidades de zimoliasa ZymoResearch). Mezclar pipeteando la solución dentro y fuera de una punta de pipeta. </li><li> Incubar a 30 ° C durante 1 hr. </li><li> Añadir 50 l de 0,02% de NP-40. Mezclar pipeteando la solución dentro y fuera de una punta de pipeta. </li><li> Deje el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos. </li><li> Añadir 500 ul de agua. </li><li> Colocar el tubo en hielo. </li><li> Sonicar esta mezcla dos veces en el ajuste de salida de 1 (débil ajuste) durante 15 segundos utilizando una micropunta de 3,2 mm con Sonifier 450 (Branson). Entre las dos rondas de tratamiento con ultrasonidos, poner el tubo en hielo para recuperar la temperatura de 0 ° C ~ </li><li> Centrifugar los tubos a 800 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 200 l de SC-Ura-His(A) o SC-Ura-Leu (α) medio, dependiendo de si la cruz es para la incorporación de una o GMToolkit-α-GMToolkit. Para preparar el medio, hacer SC-Ura-His-Leu medio (0,67% de base nitrogenada de levadura, 2% de glucosa, 0,01% de arginina, 0,01% de ácido aspártico, ácido glutámico 0,01%, 0,01% de isoleucina, 0,01% de lisina, 0,01% de metionina , 0,01% de fenilalanina, 0,08% de serina, treonina 0,04%, 0,002% de tirosina, valina 0,03%, 0,0025% de adenina, 0,005% de triptófano, 0,003% de adenina, y 0,005% de triptófano) y lo complementan con histidina o leucina estéril antes de su uso para la concentración final de 0,01%. </li><li> Hacer un agujero en la tapa usando una chincheta trató con 70% de etanol. </li><li> Girar el tubo en posición horizontal a 30 º C durante 2 días. El eje de la rotación debe ser paralelo al eje longitudinal del tubo. </li><li> Streak las células en una placa de agar SC-Ura-His o SC-Ura Leu-(los ingredientes y además: un 2% de agar, ácido aspártico y treonina debe ser añadido después de unutoclaving, añadir histidina y leucina antes de servir) para hacer colonias aisladas de las cepas ProMonster. </li></ol> 2. Ciclismo Sexual <ol><li> Girar un cultivo de una cepa de GFP supresión establecido en 100 l de SC-His (a) o SC-Leu (α) en función de tipo de apareamiento a 30 º C durante la noche usando un tubo de 1,6 ml Eppendorf. Para el intercambio de aire, hacer un agujero con un alfiler tratados con etanol al 70%. Gire el tubo horizontal. El eje de la rotación debe ser paralelo al eje longitudinal del tubo. Es posible cruzar a través de múltiples cepas de apareamiento en masa. Cuando una muestra según se usa directamente para este propósito, cultivar las células en 200 ul a 30 º C durante 2 días. Para preparar el medio, añadir uracilo (concentración final: 0,0025%) e histidina (0,01%) o leucina (0,01%) a SC-Ura-His-Leu medio. </li><li> Mezclar 250.000 a-haploides y 250.000 células haploides α-células de supresión cepas GFP en un Eppe 1,6 mlndorf tubo. Vortex. </li><li> Aparearse estas células por los siguientes pasos (1,11) - (1,17). </li><li> Transferir 10 l de la mezcla a 500 apareamiento medio GNA l que contiene 200 mg / ml de G418 y 100 mg / ml Nat. en un tubo de cultivo de 5-ml con una tapa aflojada. La partida OD 600 es aproximadamente 0,1. </li><li> Girar el cultivo a 30 ° C durante 24 hr. Esto permite la selección de diploides porque diploides sólo contiene tanto KanMX4 en GMToolkit-a y NatMX4 en GMToolkit-α puede crecer en presencia de G418 y Nat (Figura 3). </li><li> Transferir 20 l de la cultura de un día y 500 l de GNA fresco que contiene G418 y NAT. La partida OD 600 es aproximadamente 0,2. </li><li> Girar el tubo a 30 ° C durante 5 horas para llevar las células a la fase log (OD 600 de ~ 1). </li><li> Siga los pasos (1,24) - (1,38) para esporular los diploides y aislar esporas. </li><li> Dividir la suspensión de células esporuladas en dos 300-lpartes y poner cada uno en un aparte de 1,5 ml tubo Eppendorf. </li><li> Centrifugar los tubos a 800 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para el sedimento de un tubo, añadir 100 ml de SC-Su medio para seleccionar una haploides. Para la pastilla del otro tubo, añadir 100 ml de SC-Leu medio para seleccionar α haploides. </li><li> Gire los tubos a 30 ° C durante la noche. La final OD 600 debe ser inferior a 0,5. Si OD 600 tiende a ser demasiado alto, tratar el cultivo a temperatura ambiente. </li><li> Para inducir la GFP, añadir 100 l de fresco SC-His (a) o SC-Leu (α) que contenía 20 mg / ml de doxiciclina. La concentración final de la doxiciclina es 10 mg / ml. Vortex. </li><li> Girar los tubos a 30 ° C durante 2 días. </li></ol> 3. Citometría de Flujo <ol><li> Añadir 900 l de pre-filtrada tampón TE (pH 7,5) que contenía 10 mg / ml de doxiciclina a un tubo de polipropileno de 5-ml (BD Falcon # 352063) con la tapa intercambia con una célulacolador tapa de un tubo de poliestireno de 5-ml (BD Falcon # 352235). Tubos de polipropileno son adecuados para citometría de flujo. La tapa del colador se desea para eliminar partículas grandes. </li><li> Coloque con cuidado 75 l de tampón TE con doxiciclina en la tapa de la celda-colador. </li><li> Añadir 25 l de las células inducidas a la solución de la tapa. </li><li> Mientras presiona la punta del Pipetman contra la malla, tirar toda la solución combinada a través del filtro. </li><li> Presione hacia abajo la tapa del filtro y el tubo de vórtice. </li><li> Preparar los tubos de recogida (1,6 ml tubos Eppendorf) llenos con 200 l de SC-His-Leu-o SC. </li><li> Inicie el clasificador de células y ajustar la configuración de acuerdo con el manual del fabricante. </li><li> Vortex tanto el tubo de recogida (para revestir la pared con el medio) y el tubo que contiene las células antes de cargarlos en el clasificador de células. </li><li> Adquirir datos de citometría de flujo de la muestra. Una cepa no contiene GFP puede ser un control negativo. </li><li> Dibuja puertas para la clasificación. (A)Para evitar que los agregados de células, lo que podría exhibir la intensidad GFP alta, descartar los valores extremos con un ancho de pulso desproporcionadamente grande para dispersión frontal (FSC) con una parcela de ancho de pulso y la altura del pulso para MoFlo clasificador o altura FSC desproporcionadamente pequeña con una parcela de altura FSC y FSC área para FACSAria clasificador (Figura 5, arriba a la izquierda del panel). (B) Dado que gran FSC (área) se espera para los agregados celulares, sólo tienen células en la parte baja del 20% en FSC, evitando al mismo tiempo las regiones con menor dispersión FSC y lateral (SSC) valores donde a menudo se encuentran los restos celulares (Figura 5, superior derecha del panel). (C) SSC (área) y la señal de GFP (área) a menudo se correlacionan positivamente. Porque simplemente tomando las más brillantes células dadas las puertas anteriores también se enriquecería por células con un alto valor SSC, dibujar una puerta a lo largo de la periferia de la población mediante un gráfico de la intensidad de las buenas prácticas agrarias y la cooperación Sur-Sur para tomar un porcentaje similar de los más brillantes de células de cada punto del eje SSC (Figura 5, Bottom-izquierda diagrama). La población seleccionada en (C) debe ser 0.1-1% de la población seleccionada en (B). </li><li> Ordenar 200 células en el tubo de recogida dados los criterios de (3,10). Para un proceso en masa o para otros proyectos que requieren una población más complejos, ordenar más células según sea necesario. </li><li> Vortex el tubo de recogida para cubrir las células clasificadas con el medio. </li><li> Placa de un subconjunto de células (por ejemplo, 50 células) en una placa YPDA para la genotipificación. </li><li> Incubar la placa a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Hacer un lisado durante ~ 12 colonias siguiendo los pasos (1,5) - (1,8). </li><li> Transfiera las células residuales en la punta utilizada en (1,5) a un punto en un plato que contiene YPDA G418 y Nat tocando suavemente la placa con la punta. Haploides seleccionados no deben crecer en esta placa. Diploides puede tener más copias buenas prácticas agrarias y por lo tanto puede ser más brillante. Esta prueba puede mostrar la eficiencia de la selección haploide. </li><li> Para la genotipificación, 1 l de analizar el lisado utilizando un 10-l PCR reaction con un cebador directo que hibrida con la región flanqueante aguas arriba de cada gen suprimido emparejado con un cebador de la secuencia CCTGAGAAAGCAACCTGACC. Multiplex PCR reacciones si es posible (condiciones se pueden determinar usando lisados ​​de mutantes individuales). PCR puede realizarse en un 96 - 384 o bien formato. Este último formato es adecuado para el volumen de reacción de tan poco como 5 l. Arraying de PCR mezclas de reacción que difieren en la adición de cebadores y lisados ​​de células a estas mezclas pueden ser llevadas a cabo utilizando una pipeta multicanal o un robot de manejo de líquidos. Tip cambios son opcionales cuando se añade el lisado mismo a diferentes mezclas de PCR. </li><li> Analizar los productos de PCR. El sistema Gel XL Ultra V-2 electroforesis (Labnet) es compatible con la carga de la muestra utilizando pipetas multicanal. </li><li> Basado en información de (3,16) y (3,18), identificar los haploides probables que han deseadas genotipos. </li><li> Establecer estas cepas en un plato fresco (YPDA, CAA-Ura, o SC-Ura-His/Leu). Además, los congelan en25% de glicerol a -80 ° C. Las pruebas adicionales como confirmación de la ausencia de tipo salvaje secuencias de los genes suprimidos y de campo pulsado electroforesis en gel se recomienda. </li><li> Repita el ciclo sexual de (2,1) con cepas útiles. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

A medida que desarrollamos el enfoque Monstruo Verde, estábamos preocupados con la posibilidad de recombinación entre diferentes cassettes GFP reemplazo, lo que lleva a la reordenación del genoma. Mitigar contra de esta posibilidad es nuestra selección para las células que han superado con éxito múltiples rondas de apareamiento y la meiosis. Las células que llevan genomas reordenados se espera que sean menos aptos después del apareamiento con las células sin un reordenamiento idénticos. En efecto, no se obser...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o instrumento </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Disolver en agua y filtrar esterilizar-(0,2-m filtro). Concentración Stock: 200 mg / ml. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER agentes biológicos </td><td> 5001000 </td><td> Disolver en agua y filtrar esterilizar-(0,2-m filtro). Concentración Stock: 100 mg / ml. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Disolver en etanol al 50% y esterilizar por filtración-(0,2-m filtro). Concentración de stock: 10 mg / ml. Hacer fresco cada cuatro semanas. Escudo de la luz con papel de aluminio y se almacena a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Levadura Difco base nitrogenada w / o aminoácidos </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotor para tubos) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel XL unidad de electroforesis </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip para Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria clasificador de células </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo clasificador de células </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek robot FX o equivalente </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Opcional. Para la creación de informes de terminación de genotipado. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Fenotipos para un gen de supresión a menudo se revela sólo cuando la mutación se prueba en un fondo genético particular o 1,2 condición ambiental. Hay ejemplos en los que muchos genes deben ser eliminados para desenmascarar funciones ocultas genes 3,4. A pesar del potencial para descubrimientos importantes, las interacciones genéticas que involucran tres o más genes son en gran parte inexplorado. Búsquedas exhaustivas de múltiples interacciones mutantes sería poco práctico debido a la gran cantidad de posibles combinaciones de supresiones. Sin embargo, los estudios de conjuntos seleccionados de genes, como los juegos de paralogs con un mayor priori la posibilidad de compartir una función común, sería informativo. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, gen knockout se logra mediante la sustitución de un gen con un marcador seleccionable mediante recombinación homóloga. Debido a que el número de marcadores es limitado, se han desarrollado métodos para retirar y volver a utilizar el sam<html> e 5,6,7,8,9,10 marcador. Sin embargo, las mutaciones de ingeniería secuencialmente múltiples utilizando estos métodos lleva mucho tiempo debido a que el tiempo requerido amplía de forma lineal con el número de deleciones que se genera. A continuación se describe el método de Monstruo Verde para rutinariamente la ingeniería de múltiples eliminaciones en la levadura 11. En este método, una proteína verde fluorescente (GFP) reportero integrado en deleciones se utiliza para las cepas de etiquetas cuantitativamente de acuerdo con el número de deleciones contenidas en cada cepa (Figura 1). Rondas repetidas de surtido de GFP-marcados deleciones a través de apareamiento de levadura y la meiosis junto con citometría de flujo de enriquecimiento de las cepas que llevan más de estas deleciones conducir a la acumulación de deleciones en las cepas (Figura 2). Realización de varios procesos en paralelo, con cada proceso de incorporar una o más supresiones por ronda, reduce el tiempo necesario para la construcción de la cepa. contenido &quot;&gt; El primer paso es preparar un solo haploides mutantes llamado &#39;ProMonsters&#39;, cada uno de los cuales lleva un reportero GFP en un locus eliminado y uno de los &#39;toolkit&#39; loci, ya sea GMToolkit-un monstruo verde o GMToolkit α-en el . can1Δ locus (Figura 3) utilizando cepas de la colección de supresión de levadura 12, GFP-marcadas deleciones pueden ser convenientemente generado mediante la sustitución de la casete KanMX4 común existente en estas cepas con una GFP universal - URA3 Cada fragmento contiene GMToolkit:. sea la a - o α-apareamiento de tipo específico del marcador de selección haploide 1 y exactamente uno de los dos marcadores que, cuando ambos están presentes GMToolkits, colectivamente permiten la selección de diploides. El segundo paso consiste en llevar a cabo el ciclo sexual a través del cual loci de deleción se pueden combinar en una sola célula por la variedad aleatoria y / o RECOMB meióticaminación que acompaña a cada ciclo de apareamiento y la esporulación.

Cuando una cepa haploide a-con cuatro supresiones marcadas GFP-(ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) se cruzó con una cepa haploide-α con cuatro supresiones (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), con dos deleciones (ycl033cΔ yer042wΔ) compartida por dos cepas, un representante resultado se obtuvo. La mezcla de apareamiento se cultivaron en medio YPDA contenía G418 y Nat para seleccionar los diploides. Los diploides resultantes se cultivaron en medio de esporulaci?...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

El método monstruo verde permite el montaje rápido de deleciones múltiples marcados con un gen reportero que codifica la proteína verde fluorescente. Este método se basa en la conducción de las cepas de levadura a través de ciclos repetidos de surtido sexual de las deleciones y de enriquecimiento basado en la fluorescencia de las células que llevan más deleciones.

El Proceso de Monstruo Verde para la generación de cepas de levadura que llevan deleciones múltiples genes

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vistas.  J. Craig Venter Institute. El método monstruo verde permite el montaje rápido de deleciones múltiples marcados con un gen reportero que codifica la proteína verde fluorescente. Este método se basa en la conducción de las cepas de levadura a través de ciclos repetidos de surtido sexual de las deleciones y de enriquecimiento basado en la fluorescencia de las células que llevan más deleciones.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Una técnica rápida para la visualización en vivo de las células de levadura inmovilizada

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...