Los autores reconocen Ryan Chaplin y el Dr. Gregg Rentfrow de la Universidad de Kentucky Meats Lab y el Departamento de Ciencia Animal y de alimentos para proporcionar oportunidades para recoger tejidos experimentales utilizadas en este documento.

Los procedimientos utilizados en este estudio no requieren la aprobación de la Universidad de Kentucky Cuidado de Animales y el empleo Comisión porque no se utilizaron animales vivos. Antes de la recolección de cualquier muestra utilizada en este documento, todos los animales fueron aturdidos con perno cautivo y se desangraron. Esto se llevó a cabo en una instalación de matadero inspección federal en la Universidad de Kentucky. Un representante oficial de la Seguridad e Inspección de los Alimentos del USDA observó todas las actividades que se ocupan de los animales vivos y la manipulación de la canal. 1 Preparación de Instrumentación <ol><li> Para minimizar la cantidad de tiempo entre las colecciones de muestras de tejido para el inicio de un experimento, fije el equipo y preparar tampones antes de recoger el tejido experimental (o si el personal adicionales están disponibles, estas tareas pueden ocurrir simultáneamente). NOTA: Esto no sólo proporciona la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos, pero algunosexperimentos pueden correr durante largos períodos de tiempo (o si hay un deseo de completar múltiples experimentos en un día), por lo tanto, suele ser conveniente empezar tan pronto como sea posible. </li><li> Encienda el ordenador asociado, equipos adquisiciones de datos, baño de agua (para el tampón (s)) y myograph unidad (s). Coloque el equipo de calibración en la unidad (s) myograph y encienda el calor myograph (predefinido a 37,5 ° C) y permitir que las unidades y equipos de calibración para calentar para preestablecer las temperaturas. <ol><li> Abra un archivo de configuración de software gráfico creado anteriormente en el equipo y empezar una carrera (pero no la adquisición de datos). </li></ol></li><li> Caliente el equipo durante 10 minutos. <ol><li> Iniciar la adquisición de datos. </li><li> Cero todos los canales. </li><li> Compruebe, y llevar a cabo la calibración (si es necesario) en cada canal (4 canales por multimyograph) para estandarizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva asociada a ese canal a una fuerza de 2 g suministrada por un peso certificado. </li><li> Una vez completados calibración y una conversión de unidades, almacenar todos los datos posteriores como gramos. Cambie en consecuencia sobre la base de los deseos de cada laboratorio independiente; el equipo y el software permiten el uso de otras unidades, tales como miliNewtons y voltios. </li></ol></li><li> Asegúrese de que las líneas de gas están libres de obstrucciones y abra el suministro de gas (95% O 2/5% CO 2) a Myograph (s) unidades. Gas continuamente todos los tampones (en las cámaras Myograph) durante todo el procedimiento. </li><li> Rellene todas las cámaras Myograph con etanol al 70% y en remojo durante 10 minutos, retirar el etanol, y repita para un segundo 10 minutos en remojo. <ol><li> Tras eliminación del etanol, enjuáguese la boca tres veces con agua desionizada, seguido de tres lavados con tampón preparada (vea la Sección 2 para la preparación de buffer), dejando la tercera adición de tampón en las cámaras. NOTA: En este punto, el equipo puede permanecer inactivo en este estado hasta que se preparan búfer y el tejido y el personal está listo para proceder con los experiment. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de tampones <ol><li> Preparar una solución tampón de 1 L de Krebs-Henseleit para su uso en el transporte y procesamiento de muestras de tejido para alcanzar concentraciones finales de 11,1 mM de D-glucosa; 1.2 mM MgSO4; 1.2 mM KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl 2; 24,9 mM NaHCO3. <ol><li> Mezclar 9,6 g de sales de Krebs en aproximadamente 900 ml de agua desionizada sobre una placa de agitación. </li><li> Mezclar en 0,373 g de cloruro de calcio deshidratado seguido de 2,1 g de bicarbonato de sodio por litro de tampón deseado. </li><li> Gas solución tampón durante 20 minutos con 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Después de gasificación, ajustar el pH a 7,05 (filtración de tampón aumenta el pH; pH objetivo final debe ser 7.4) y ajustar el volumen de 1 L. </li><li> Filtrar esterilizar tampón en una botella y almacén intermedio de medios 1 L autoclave limpio a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li></ol></li><li> Preparar separada Krebs-Hsolución tampón enseleit para su uso en experimentos Myograph como se describe en el paso 2.1 para el transporte tampón de Krebs-Henseleit con compuestos adicionales que se refieren a los experimentos de la contractilidad. NOTA: Por lo general 2 L será suficiente para los experimentos descritos en este artículo, pero puede necesitar este volumen para aumentar o disminuir según la duración del experimento, el número de cámaras Myograph y reemplazos de amortiguamiento número (en relación con las adiciones de tratamiento). <ol><li> Antes de la etapa de gasificación (paso 2.1.3), añadir 9,1 mg (por L de tampón está preparado) de desipramina-HCl para amortiguar. </li><li> Preparar una solución de propranolol-HCl 1,0 M y añadir 1 ml (por L de tampón está preparado) de esta solución a la solución de tampón de Krebs-Henseleit. Hacer este tampón el día de uso y mantener a temperaturas Myograph operativo (una temperatura que produce una temperatura de 37,5 ° C en el myograph). NOTA: La desipramina se añade para inhibir los mecanismos selectivos de la recaptación de aminas biógenasy permitir la limpieza de adiciones experimentales de la memoria intermedia de baño de los vasos sanguíneos que se produzca más rápidamente. La adición de propranolol evita que la unión no específica de compuestos de tratamiento para β-adrenérgicos receptores. </li></ol></li></ol> 3. Recogida y preparación de la vasculatura <ol><li> Tan pronto como sea posible, retire el tracto gastrointestinal de la canal. Una vez que el animal ya no exhibe ningún reflejo involuntario, quitar la cabeza y ocultar y levante la carcasa verticalmente. La eliminación de las vísceras gastrointestinal (esófago hasta el ano) de la canal debe ser completado por el personal de matadero autorizado (&lt;20 min de tiempo de aturdimiento). NOTA: ¿Qué tan pronto, es generalmente limitada por la ubicación / instalación donde ésta se obtiene el tracto intestinal desde y procedimientos operativos estándar o procedimientos por mandato federal, seguidos por los personal de la instalación. <ol><li> En la mayoría de instalaciones, llevar a cabo manipulaciones del tracto gastrointestinalen un lugar separado de la transformación de la canal que está destinado a entrar en el suministro de alimentos. Utilice las inmediaciones conveniente que el tracto gastrointestinal se puede tomar y hacia fuera para su examen. </li></ol></li><li> Una vez que el tracto gastrointestinal se extendió a cabo, identificar el intestino delgado, el pliegue ileocecal que conecta el intestino delgado al intestino ciego, y la brida que se extiende ileal proximal al pliegue ileocecal (Figura 1A). <ol><li> Usando un bisturí o cuchillo, muy ligeramente hacer una incisión en la membrana mesentérica en el centro de la brida ileal. El uso de dos dedos índices, sin rodeos diseccionar la grasa y el tejido conectivo exponer la vasculatura mesentérica (Figura 1B). </li></ol></li><li> De esta brida o protuberancia en el mesenterio intestinal, diseccionar múltiples ramas (~ 2 cm de longitud) de los haces de la arteria y la vena mesentérica expuestos que apoyan esta porción del íleon (Figura 1C). <ol><li> Si ucantar unas pinzas para agarrar el tejido, tenga cuidado de no captar directa o tirar de los vasos sanguíneos en absoluto, mientras que la eliminación de ellos como cualquier tipo de estiramiento puede dañar y afectar negativamente el rendimiento de tejido 14. Eliminación de los vasos sanguíneos se realiza mejor, cortando a través de cada extremo de la sección que ser eliminado y luego cortar junto o en paralelo a la sección de ahora aislado. Para facilitar, eliminar parte del tejido circundante, junto con los vasos para proporcionar un poco de tejido para captar con un par de fórceps. </li><li> Con un par de pinzas, sumerja muestra de tejido en un tubo que contiene hielo frío tampón de Krebs-Henseleit y almacenar en hielo hasta el procesamiento puede ocurrir en el laboratorio. </li></ol></li><li> Coloque la muestra de tejido sobre una superficie de corte o en una placa de Petri y sumerja parcialmente en hielo frío de Krebs-Henseleit. <ol><li> Utilizando # 5 joyeros fórceps, tijeras iris Noyes, y de aumento de la lámpara o la disección de alcance (2,5 a magnificación 5.0X es suficiente), diseccionar cuidadosamente lejos la connecti grasa y rodeacinco tejidos y separar la arteria y la vena. La identificación de la abertura del recipiente en un extremo de la sección y comprender cuidadosamente la fascia que rodea el recipiente con los fórceps. </li><li> Hacer un corte con las tijeras paralela al recipiente deslizando la punta de la tijera debajo de la fascia elevada. Después de la incisión inicial, la grasa y los tejidos conectivos se pueden separar más lejos de la embarcación mediante la reducción de cada lado con las tijeras. Asegúrese de que los vasos son tan limpias como sea posible y reducir al mínimo la cantidad de tiempo que los buques pasan en el banquillo. </li><li> Volver vasos sanguíneos para tubos de fresco tampón de Krebs-Henseleit y se almacenan a 4 ° C (muestras pueden permanecer almacenado durante un máximo de 24 horas después de la recolección y todavía producir datos válidos de la contractilidad). </li><li> Utilizando una hoja de afeitar, buque rebanada que se utilizará en myograph en número deseado de secciones de 2 mm (que es útil usar una máquina de cortar el tejido para obtener secciones transversales consistentes). </li><li> Examine cada sección bajo un sco de disecciónpe (ampliación 12.5X) para asegurar que cada sección tiene ninguna anormalidad, ramas, válvulas, o daños superficiales inadvertidamente hecho durante la disección y la limpieza. Reemplazar la sección de recipiente de si hay alguna anormalidad, rama, válvula, o daño superficial. </li></ol></li><li> Secciones Tienda aceptables rodajas de buques (sumergidos en tampón Krebs-Henseleit) en hielo oa 4 ° C hasta que esté listo para el montaje en cámaras Myograph (generalmente &lt;30 min). </li><li> Montar suavemente el recipiente en la myograph mediante la inserción de los soportes a través del lumen y aumentar la tensión (utilizando el microposicionador en el myograph) teniendo cuidado de no estirar los vasos por encima de un 2 a 3 g lectura. </li><li> Una vez que todas las cámaras están cubiertos, aspire el búfer de todas las cámaras y vuelva a llenar con 5,0 ml de tampón y se iniciará un temporizador de 15 minutos para comenzar el período de equilibrio y el experimento. </li></ol> 4. Experimento <ol><li> Equilibrar todas las secciones de los vasos durante 1,5 horas para lograr una res establesting tensión de 1,0 g. <ol><li> Vuelva a colocar el tampón de incubación Krebs-Henseleit cada 15 min. </li><li> Durante el equilibrado, constantemente ajustar la tensión en las secciones de los vasos sanguíneos hasta 2 g y se deja relajar hasta aproximadamente 0,80 g. Trate de no permitir que los vasos se relajen demasiado (que pueden salirse de las monturas). Trate de lograr una tensión de línea de base estable, donde el buque tiene 1 g de tensión sin necesidad de ajuste. </li></ol></li><li> Durante el equilibrado, preparar una solución acuosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como una referencia. </li><li> Tras la finalización de un equilibrio satisfactorio, añadir 500 l de la solución de KCl 1,32 M para dar lugar a una solución 0,12 M en la solución de 5,5 ml de bañar el recipiente. <ol><li> Después de la adición de la M KCl 1,32, no ajustar la tensión manualmente como la respuesta máxima de esta adición se utiliza para evaluar la viabilidad del tejido y se puede utilizar para normalizar los datos de tratamiento (por ejemplo, las respuestas a una concentración de ungonist). </li><li> Vuelva a colocar la memoria intermedia en intervalos de 15 minutos hasta que la tensión ha vuelto al valor basal de 1,0 g. </li></ol></li><li> Una vez que se alcanza la línea de base, cambiar el tampón y comenzar simultáneamente un temporizador de 1 min. Haga esto para todas las cámaras al mismo tiempo para evitar un escalonamiento de las horas de inicio. <ol><li> Vortex el estándar que se añade y preparar un comentario para cámara 1 durante la cuenta regresiva 1 min. </li><li> Añadir las normas en 25 ml de alícuotas a cada cámara como los dictados del experimento (esto mantiene el tratamiento por debajo del 0,5% del volumen total). </li><li> Cuando se ha añadido la última norma, iniciar un temporizador 9 min. </li><li> Al final de la incubación estándar de 9 min, eliminar el tampón que contiene el tratamiento de las cámaras y añadir 5,0 ml de tampón fresco, e iniciar el temporizador de 2,5 min. </li><li> Repita el paso 4.4.4. </li><li> Al final del segundo enjuague 2,5 minutos, aspirar las cámaras y añadir tampón nuevo, y comenzar un temporizador de 1 minuto la cuenta atrás del inicio de la segundad adición estándar. </li></ol></li><li> Continuar este ciclo para todos adiciones estándar del día. </li><li> Durante la adición norma final y la posterior incubación 9 min preparar el compuesto de referencia M KCl 1,32 para una final de la adición de dosis de referencia de ejecución de 500 l. </li><li> Tras el intervalo de 1 min después de la adición tratamiento final, añadir el KCl y iniciar un temporizador 9 min. NOTA: La adición de KCl es para confirmar la viabilidad del tejido a la conclusión del experimento y es útil si la administración de un tratamiento que resulta en respuesta insignificante. </li><li> Al concluir el 9 min de incubación compuesto de referencia final, aspire o eliminar el tampón de todas las cámaras. No añadir tampón fresco. Concluir el experimento. </li><li> Guarde el archivo gráfico, eliminar secciones de los vasos sanguíneos y disponer de forma adecuada, y seguir el protocolo de limpieza (proporcionado por el fabricante y pueden ser específicas de laboratorio) para el equipo myograph. </li></ol>

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La mención de su nombre comercial, producto patentado, o equipo especificado no constituye una garantía o garantía por el USDA y no implica la aprobación de la exclusión de otros productos que pueden estar disponibles.

El desafío inicial en el desarrollo de este bioensayo fue el establecimiento de un punto de recogida repetible para la vasculatura mesentérica. Consistencia sitio de la muestra es crítica, ya que algunas de las funciones del cambio del intestino delgado durante la progresión desde el yeyuno a través del íleon y en consecuencia el mesenterio varían en un patrón similar. Las ramas ileales de la arteria mesentérica y la vena son los más fácilmente identificados a través de puntos de referencia anatómicos. Al u...

Las alteraciones en el flujo de sangre a un lecho de tejido pueden tener un gran impacto en la función del órgano. Una función principal del intestino delgado es la absorción de nutrientes. Se requiere el flujo de sangre arterial a la superficie de absorción del intestino para absorción aumenta y el flujo sanguíneo de nutrientes para ayudar en la absorción de nutrientes como la digesta se mueve a lo largo de la superficie 1. Una disminución en el flujo sanguíneo puede causar una reducción en la absorción de nutrientes debido a una disminución en el gradiente transepitelial 2. Además de los nutrientes, el intestino delgado también puede estar expuesto a metabolitos secundarios, drogas o toxinas que ejercen un efecto sobre el flujo de sangre localizada en el mesenterio. En el caso de que el animal rumiante, los compuestos pueden ser liberados de un pienso (por ejemplo, nutrientes tales como aminoácidos, o toxinas tales como alcaloides del cornezuelo del centeno) a través de procesos fermentativos del intestino anterior. Si estos compuestos sobreviven el metabolismo microbiano de la fermentación ruminal, que ahora están disponibles para la absorcióno la interacción a medida que viajan a través del tracto gastrointestinal del animal. Hay un número de diferentes métodos disponibles para medir el flujo sanguíneo in vivo (por ejemplo, el ultrasonido Doppler, medidores de flujo de sangre mora, microesferas radiomarcadas, y técnicas de indicador de dilución) que permiten la evaluación de diversos escenarios o tratamientos experimentales. Sin embargo, para obtener información con respecto a las propiedades mecánicas o farmacológicas de músculo liso vascular, los métodos fueron limitadas a los grandes buques hasta Mulvany y Halpern 3 publicaron un artículo que describe una técnica que utiliza alambre montado preparaciones anillo vascular en un myograph. Desde el desarrollo de esta técnica, las modificaciones se siguen realizando a los sistemas Myograph asociados que permiten una variedad de aplicaciones diferentes para la evaluación de las estructuras tubulares. El sistema también se ha adaptado para utilizar varillas fijas para el montaje de los buques más grandes 4, donde la perfusióntécnicas no son deseados. Debido a diferencias en los vasos de diferentes orígenes anatómicos y distinciones en los mismos buques de diferentes especies de animales, datos de buque y tipo de animal no puede ser fácilmente extrapolado a través de diferentes embarcaciones o el mismo recipiente en diferentes tipos de animales 5. En consecuencia, los bioensayos separados deben ser desarrollados y validados en cualquier momento se cambian estos aspectos. Recientemente, varios bioensayos se han desarrollado con estas tecnologías para el uso en el ganado lateral vena safena derecha y la arteria y la vena ruminal 6,7. Este bioensayo se desarrolló para investigar específicamente los efectos que tienen los alcaloides del ergot en la vasculatura de soporte del intestino delgado. Se informó de que el 50-60% de alcaloides alimentados aparece en el contenido del abomaso, pero sólo el 5% se recuperó en las heces 8. Strickland et al. 9 declaró en una revisión de los alcaloides del cornezuelo de centeno, que PV datos disponiblesest que el intestino delgado puede ser el sitio más importante para la absorción Ergopeptine. Eckert et al. 10 aspectos biofarmacéuticos crítica de alcaloides del cornezuelo de centeno y afirmaron que una vez que cruzan la barrera epitelial, alcaloides del cornezuelo de centeno se transporten, bien por el sistema linfático a la vena subclavia o por medio de la vena mesentérica y en la sangre portal. Rhodes et al. 11 reportó una disminución del flujo sanguíneo hacia el duodeno y el colon en novillos que consumen una (alta de alcaloides del cornezuelo de centeno) dieta alta endofito infectadas. Usando el bioensayo de la arteria y la vena ruminal derecho, Foote et al. 12 demostraron que los alcaloides del ergot son vasoactivos en la vasculatura ruminal. Foote et al. 13 posteriormente demostraron in vivo que la exposición a los alcaloides del cornezuelo de centeno ruminal resultados en un rumen disminución del flujo sanguíneo epitelial. Esta disminución en el flujo sanguíneo a la superficie de absorción del rumen de forma concomitante causó una reducción en nutrientes (ácidos grasos volátiles) de flujo. Dada la quantity de alcaloides del cornezuelo de centeno que pasan en el intestino delgado del intestino anterior; se planteó la hipótesis de que se produzca un efecto similar en la pequeña vasculatura intestinal y la absorción de nutrientes. Esto requirió el desarrollo de la bioensayo arteria mesentérica y vena ileal proximal bovina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="611">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comment/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Multi Myograph</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">610M</td>
			<td style="width:259px;">A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">Powerlab 8/sp</td>
			<td style="width:127px;">ADIntruments</td>
			<td style="width:120px;">ML785</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">LabChart 7</td>
			<td style="width:127px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:120px;">Version 7</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Force Calibration Kit</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">100055</td>
			<td style="width:259px;">Specific to DMT myographs</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Bottle-top Filter</td>
			<td style="width:127px;">Nalgene</td>
			<td style="width:120px;">595-4520</td>
			<td style="width:259px;">0.22 um pore size; 45 mm neck size</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">#5 Jewler&#8217;s Forceps</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">555008FT</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of forceps can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Noyes Iris Scissors</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">18-1510</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of scissors can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Dissecting Scope</td>
			<td style="width:127px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of dissecting light microscope will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Adjustable Tissue Matrice</td>
			<td style="width:127px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:120px;">TM C12</td>
			<td style="width:259px;">This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Krebs-Hensleit Buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">K3753-10x1L</td>
			<td style="width:259px;">It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Calcium chloride dehydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S5761-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Desipramine-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D3900-5G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Propranolol-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0884-1G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">KCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P9333-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:105px;">95% O2/5% CO2</td>
			<td style="width:127px;">Scott Gross</td>
			<td style="width:120px;">UN3156</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Sistemas digestivo de los mamíferos están constantemente expuestos a compuestos (deseables e indeseables) que pueden tener un efecto sobre el flujo de sangre hacia y desde ese sistema. Los cambios en el flujo de sangre al intestino delgado puede resultar en efectos en las funciones de absorción del órgano. Especial interés en las toxinas liberadas de los piensos a través de procesos fermentativos y digestivos en rumiantes ha desarrollado como un área donde las eficiencias productivas se podrían mejorar. El vídeo asociado con este artículo se describe un bioensayo in vitro desarrollado para seleccionar compuestos para vasoactividad en aislados secciones transversales de la arteria mesentérica bovina y la vena utilizando un multimyograph. Una vez que los vasos sanguíneos se montan y se equilibraron en el myograph, el propio bioensayo se puede utilizar: como una herramienta de detección para evaluar la respuesta contráctil o vasoactividad de compuestos de interés; determinar la presencia de tipos de receptores por la orientación farmacológicamente receptores con agonista específicos; determinar el papel de un receptor con la presencia de uno o más antagonistas; o determinar las posibles interacciones de los compuestos de interés con los antagonistas. A través de todo esto, se recogen datos en tiempo real, el tejido recogido de un solo animal puede ser expuesto a un gran número de diferentes tratamientos experimentales (una ventaja in vitro), y representa la vasculatura a cada lado de la cama capilar para proporcionar una precisa imagen de lo que podría estar sucediendo en la aferente y eferente suministro de sangre apoyar el intestino delgado.

Los vasos sanguíneos que se usa para generar los resultados incluidos se obtuvieron de 6 novillos Holstein (425 ± 8 kg) dentro de un intervalo de 3 semanas. Un ejemplo de un típico mesentérica respuesta contráctil a KCl vena y adiciones crecientes de tratamiento en la concentración se presenta en la Figura 2. La magnitud de la respuesta variará algunos con el tamaño de la embarcación (correlacionada con el tamaño del animal donante), pero puede también ser influido (negativamente) por un mane...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad.

El aislamiento y uso de las Secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la Prueba de Vasoactividad en el intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K vistas.  USDA-Agricultural Research Service.  El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad. 

Video: Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Una estrategia para identificar mutaciones de novo en los trastornos comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Investigación

Medicina

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contracción de la arteria mesentérica y Estudios de relajación con miografía cable automático

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Adultos Mouse hipertensión venosa: Modelo: arteria carótida común a la vena yugular externa anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

La cateterización de la arteria carótida y la vena yugular para realizar mediciones hemodinámicas, Infusiones y muestras de sangre en un modelo de rata Consciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Un dispositivo sencillo de preparar rápidamente enteros Montes del Intestino Ratón

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Mecanismos subyacentes de la secreción de la hormona del intestino utilizando los aislados perfusión intestino de rata

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...