The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. Crianza Ae. adultos aegypti <ol><li> Los huevos eclosionan en aproximadamente ¾ de pulgada de agua en la bandeja poco profunda. El hacinamiento reducirá el tamaño de los adultos. </li><li> Larvas posterior a 25 ° C (12 hL: 12-HD) y alimentarlos con comida para peces suelo. NOTA: La sobrealimentación puede reducir las tasas de supervivencia. </li><li> Retire pupas individualmente por pipeta Pasteur diario y transferir a los platos de plástico (9 cm x 5,5 cm) dentro de pequeños cubos de contención con tapas de malla fina, estableciendo así 24 grupos de edad hr. </li><li> Alimentación mosquitos adultos 10% de solución de sacarosa por bola de algodón colocado en las paredes de pantalla de una carcasa de la jaula de los mosquitos en una cámara ambiental a 27 ° C y humedad relativa del 70% bajo el mismo fotoperiodo como larvas. </li><li> Para electrofisiología, utilice 5-10 días los animales viejos. En general, los animales más grandes producirán mejores resultados. Para el aislamiento de ARN, utilizar animales que están dentro de un mismo grupo de edad de 24 horas en el rango de edad 5-10 días. </li></ol><ol><li> Determinar una concentración adecuada de electrolito (por ejemplo, 1-10 mM) que provoca una mínima actividad de las neuronas sensoriales seleccionados. NaCl 10 mM o 1 mM KCl son electrolitos razonables para poner a prueba la actividad basal al comenzar un experimento. </li><li> Disolver cada producto químico experimental en un disolvente apropiado (si no el agua, utilizar etanol o DMSO) que tiene poco o ningún efecto sobre la actividad de pico en comparación con electrolito solo. Las concentraciones finales de etanol al 10% o 1% de DMSO son concentraciones de partida razonables. </li><li> Seleccionar apropiado (por ejemplo la quinina por amargo o sacarosa para dulces) productos químicos de control que están bien descritos disuasorias de la alimentación o estimulantes en los insectos. </li></ol> 3. Electrofisiología (grabación punta 8. La figura 1) <ol><li> Electrodos de vidrio Forma tirando mecánicamente capilares de vidrio. Optimizar calor y tire ajustes para tirar de vidrio para formar recordi forma apropiadaelectrodos NG. Romper con cuidado extremo del electrodo de vidrio usando pinzas bajo un microscopio de disección para crear electrodo de punta abertura que es lo suficientemente amplia como para envolver sensillum objetivo, pero lo suficientemente pequeño para evitar el contacto con las estructuras vecinas. </li><li> Bajo el microscopio, identificar visualmente por la morfología y la posición del objetivo sensilla / sensillum para asegurar la repetibilidad de grabación punta. Animales de preparación para permitir el libre acceso a sensilla de ángulo de entrada del electrodo. </li><li> Insectos anestesiar adultos fríos en el congelador a -20 ° C. Evitar daños a las neuronas periféricas por la sobreexposición a las bajas temperaturas. Cortar tiras angostas de cinta de celofán con hoja de afeitar en portaobjetos de vidrio. Inmovilizar todo insecto en un portaobjetos de vidrio utilizando tiras estrechas. </li><li> Insertar un alambre de tungsteno afilado químicamente en el tórax dorsal o el ojo para servir como el electrodo (tierra) indiferente. </li><li> Rellene electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 con una solución estimulante de interés. Usando una jeringa insertada, la tapa de llenadoIllary desde finales tirado al extremo romo. Flick a cabo todas las burbujas de aire, la celebración de fin derribado. Inserte un alambre de plata (cloruración opcional) en el electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 para servir como registro y electrodo de estimulación. </li><li> Conectar los electrodos a un preamplificador que está diseñado para grabaciones de contacto quimiorreceptora sensilla en los insectos. Este preamplificador (300 Hz-3 filtro de banda kHz) reducirá el tiempo de establecimiento para capturar la actividad neuronal tan cerca a los estímulos introducción posible. Recoger, almacenar y analizar las señales eléctricas utilizando un microordenador equipado con software de grabación de espiga. NOTA: Conexión a tierra del sistema de grabación correctamente puede mejorar drásticamente la relación señal-ruido. </li><li> Estimular sensilla con una solución de control (sólo electrolito) para asegurar la funcionalidad. Cuente picos a partir de 200 ms siguientes el artefacto de estímulo para todas las preparaciones. </li><li> Selección aleatoria de la orden de sustancias químicas de prueba para todos los experimentos, excepto los estudios de dosis-respuesta,para eliminar los prejuicios. Para los estudios de dosis-respuesta, exponer sensilla a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental. Permita un mínimo de 3 minutos entre estímulos para asegurar una adecuada recuperación. NOTA: Este requisito puede variar dependiendo de los insectos y sensilla. Umbral se define como la concentración para la cual el error estándar no se superponga con el error estándar para la concentración más baja ensayada. </li></ol> 4. Aislamiento de ARN y secuenciación (Figura 2) <ol><li> Preparar las majas RNasa libre herméticamente cerradas al enfriarlos en hielo seco antes de tejido disruption.Prepare acompañan majas sin RNasa para aerosol que se ajusten a los tubos de tapa a presión con fuerza. Mantenga los tubos de recogida cerrados a menos que la disección de forma activa para evitar el exceso de condensación. </li><li> Utilizando aspirador filtrada, colocar 30 a 40 mosquitos en frío anestesiados (15 seg en congelador a -20ºC) en el escenario frío y ordenar por sexo. Coloque los animales dorsal lado de abajo, agarrando las alas para no dañar apéndices gustativas.</li><li> El uso de dos pares de pinzas finas, diseccionar labella emparejado o tarsos de los machos o hembras con un microscopio de disección y limitar la inclusión de los tejidos adyacentes. NOTA: 500 labella emparejado rinde aproximadamente 800-1,000 nanogramos de mRNA total. 400 tarsos individual (5 segmentos cada uno) producen 1,200-1,800 nanogramos de mRNA total. </li><li> Con un par de fórceps-jadeantes, ligeramente captar proboscis de mosquitos justo proximal a labella exponer estiletes interiores. Uso de otro par de collection-forceps, quitar y agregar labella tejido a lado del tubo de recogida de frío. </li><li> Con un par de fórceps, ligeramente captar la pierna mosquito en la salida de la tibia y el primer segmento tarsal. Uso de otro par de pinzas, retire tarsos y añadir tejido a lado del tubo de recogida de frío. NOTA: Tener en cuenta los tipos de células en la superficie del tejido deseado y no deseado. Si bien es importante para limitar la inclusión de los tejidos vecinos, es igualmente importante no omitir porciones de tejido deseado. El fimuestra final debe representar con precisión todo el órgano de interés. Crear un límite preciso con las pinzas de agarre de tal manera que el fórceps de recogida pueden liberar precisamente por raspado o agarrar sólo el tejido deseado. </li><li> Periódicamente, de girar el tubo de recogida brevemente en 0 ° C centrifugar a 9000 xg para mantener el tejido en la parte inferior del tubo. Si la humedad se acumula en tubos de recogida durante la disección, añadir 50uL de reactivo Trizol fría para cubrir el tejido recogido. </li><li> El uso de marcadores de laboratorio anti-manchas, identificándolas claramente uno-RNasa libre de 1,5 ml encajen tubo con tapa para cada tipo de tejido para su recogida. El uso de 1,5 ml Gradilla para tubos y nitrógeno líquido, por congelación luego moler tejido en polvo fino (finas piezas si en Trizol). Repetir una vez. Aumentar el volumen total de Trizol a 1 ml y resuspender tejido fundamental por agitación. </li><li> Añadir 200 ul de cloroformo y mezclar bien. Después de 5 min a temperatura ambiente, de girar en centrífuga a 4 ° C y 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteañadir capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. Centrifugar a 11.000 x g durante 5 min. Añadir un volumen igual de RNasa libre de 70% de etanol a fluir a través y mezclar pipeta. Traslado líquido a una columna colección ARN y continuar la extracción de RNA según las instrucciones proporcionadas. </li><li> Cuantificar y evaluar la pureza del ARN total en un espectrofotómetro precisión y proceder con cualquier método de secuenciación de ARN estándar. </li></ol> 5. RT-PCR cuantitativa Validación de RNA Sequencing (Figura 3) <ol><li> Seleccione tantos genes como posible comparar relativos niveles de expresión génica en un rango dinámico, tanto en abundancia predicho secuencia y función de los genes quimiosensorial presunta. </li><li> Pares de cebadores de diseño para cada gen diana para amplificar un 100 a 180 pares de bases producto de PCR específico. Excluir amplificación gDNA no específica asegurando al menos un cebador por juego abarca un límite de intrón. También puede utilizar el tratamiento DNasa para reducir la contaminación genómica. </li><li> Recogertejido de insectos como se describe en la sección anterior. Calcular la cantidad de tejido que se requiere para proporcionar suficiente ARN para completar todas las reacciones QRT-PCR. NOTA: triplicado Biológica y reacciones por triplicado técnicos proporcionarán máxima confianza en los resultados. </li><li> Calcula la cuantificación relativa de genes como objetivo X - (Ct [target] -Ct [referencia]) para cada gen diana y medio para cada replicar, tanto biológica como técnico. Utilice gen (s) de limpieza para normalizar los valores de Ct entre las réplicas biológicas y erradicar la escala del eje Y en las comparaciones de expresión relativa. </li><li> Evaluar la similitud de RNA-seq y conjuntos de datos qRT-PCR utilizando el, procedimiento de equivalencia de arranque basado en la regresión 9, iterativa aplicado, a los datos de cada tejido. NOTA: Este procedimiento identifica la &quot;región de similitud&quot; más pequeño que puede ser construido en torno a los datos de RNA-seq y QRT-PCR observado, y permitir la expresión génica relativa medido por QRT-PCR para ser considerado estadísticamente equivalente a la medición de la expresión génica relativa por RNA-seq. </li></ol>

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	<li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220,+picaridin,+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti,+Anopheles+stephensi,+and+Phlebotomus+papatasi.">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li><li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic.">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li><li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li><li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li><li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. 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The authors have nothing to disclose.

El aspecto más difícil de potenciales de acción de grabación de sensilla gustativa es decidir qué respuestas son &quot;normales&quot;. Cuando se emplea un solo punta sensillum gustativa grabar la primera vez que una especie de insectos dado, el número total y sensibilidades de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) son probablemente desconocido. Muchas grabaciones preliminares primera obligados a decidir el alcance y las concentraciones de los productos químicos para probar. En este caso, empezamos con la obse...

Compuestos como DEET, Picaridin, citronelal y IR3535 se ha demostrado eficaz para repeler mosquitos, incluyendo las importantes vectores de enfermedades Aedes aegypti 1,2. Registramos los potenciales de acción de las neuronas sensoriales asociadas con sensilla gustativo específico para determinar las células involucradas con la repelencia de mosquitos. Junto con la secuenciación de aguas abajo de los genes expresados ​​en estos tejidos, podemos identificar los genes más probable que median las respuestas de estas células con el fin de cribar nuevos compuestos para la mejora de las capacidades de repelencia. RNA-seq es una herramienta poderosa, convirtiéndose rápidamente en estándar para el seguimiento de los cambios temporales y espaciales en la expresión génica. Análisis de RNA-seq de apéndices quimiosensoriales de insectos y los órganos se han utilizado para descubrir receptores moleculares en varias especies de insectos 3-5, mejorando en gran medida de gen convencional búsquedas basado en la PCR-6 por el gen. Los insectos representan la clase de animales más diverso, presenta muchas oportunidades para estudiar la relación entre los genes y fenotipos únicos. Tecnología de RNA-seq se puede emplear en cualquier tejido de insectos que viven. Asimismo, el registro electrofisiológico de las células sensoriales dentro de sensilla gustativa uniporous se puede lograr en muchas especies de insectos diferentes. El emparejamiento de estas dos técnicas permite a los investigadores Para limitar los genes que participan en conjunto un fenotipo observado quimiosensorial. Las diferentes especies presentarán desafíos específicos, pero pueden informar a la conexión entre los genes de los receptores quimiosensoriales y una adaptación quimiosensorial. El tamaño y la morfología de sensilla quimiosensorial es variable y pueden requerir extensa resolución de problemas durante la grabación de los potenciales de acción para reducir el ruido e identificar señales repetibles. Las disecciones de los órganos quimiosensoriales pueden ser triviales o delicada y requiere mucho tiempo, dependiendo de la morfología y el tamaño del insecto. La recuperación de ARN de alta calidad puede requerir alguna solución de problemas, así como evitar ciertos pigmentos durantela recogida de tejidos. Al tiempo que demuestran los efectos de los compuestos repelentes a través de ensayos de comportamiento es directa e informativo, este enfoque es intensiva en tiempo y amplia con respecto a mecanismo de acción. Electrofisiología junto con RNA-seq permite análisis más específicos de lo que impulsa a comportamientos de evitación en los insectos. Una vez que el &quot;kit de herramientas&quot; de la discriminación químico ha sido identificado en una especie de insecto, los intentos más específicas para mejorar en los repelentes conocidos son posibles. Los receptores y proteínas asociadas en las células sensoriales responsables de estos comportamientos pueden ser expresados ​​de forma heteróloga para la detección química directa. Además, el modelado molecular puede predecir que los productos químicos se provocar respuestas fuertes de estos receptores 7. La instantánea de todos los genes activos en un conjunto limitado de tejidos quimiosensoriales también puede ser útil en la identificación de genes similares en otras especies. Usando homología de secuencia y si la expresiónmilarities, los investigadores pueden formar conjuntos de receptores moleculares más probable que median las respuestas a los repelentes que son ampliamente eficaces en insectos. Presentamos el siguiente protocolo para ayudar a los investigadores en la deconstrucción de las vías chemosensory insectos y persuadir más que ahondar en la neuroetología de la no-modelo y los insectos de importancia económica.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Los registros de Trace de potenciales de acción de Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) demuestran la eficacia de la estimulación directa con una gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a la estimulación de cualquier producto químico contando los picos de una amplitud y duración dada durante un intervalo de tiempo razonable (generalmente menos de 500 ms). Grabaciones de rastreo deben ser fácilmente reproducible bajo un conjunto dad...

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K vistas.  United States Department of Agriculture.  El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico. 

Video: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biología

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Genética

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Electrofisiológico Grabación desde<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Nuevos Métodos para Estudiar la Codificación Gustatoria

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Inmunología e Infección

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

<meta charset="utf8"></head><body>Expresión heteróloga y análisis funcional de los receptores odorantes de Aedes aegypti a olores humanos en ovocitos de Xenopus

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

Expresión heteróloga y análisis funcional de los receptores odorantes de Aedes aegypti a olores humanos en ovocitos de Xenopus

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla

Resumen

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Capítulos en este video

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

Electrofisiológico Grabación desde

Nuevos Métodos para Estudiar la Codificación Gustatoria

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Expresión heteróloga y análisis funcional de los receptores odorantes de Aedes aegypti a olores humanos en ovocitos de Xenopus

Expresión heteróloga y análisis funcional de los receptores odorantes de Aedes aegypti a olores humanos en ovocitos de Xenopus

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,

Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos