El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para el análisis genético funcional en Anopheles gambiae a través de la modificación genética de la expresión génica de manera espaciotemporal controlada. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para la caracterización fenotípica de la expresión transgénica, incluso si se inducen costos severos de aptitud. Este sistema se puede utilizar para la caracterización fenotípica de genes potencialmente involucrados en la resistencia a insecticidas, la transmisión de patógenos o aquellos que tienen usos en métodos de control genético.
Fraser Coleman, un técnico de investigación, ayudará a demostrar este procedimiento Comience recolectando pupas usando una pipeta Pasteur de plástico de tres mililitros con el extremo cortado en un plato plano transparente adecuado para su uso con un microscopio estéreo. Retire con cuidado la mayor parte del agua alrededor de las pupas. Encienda la bombilla fluorescente y deje que se caliente.
Considere los patrones espaciotemporales de color de una expresión y proporción de diferentes fenotipos que se esperan al detectar marcadores fluorescentes. Seleccione el filtro requerido en el estereoscopio de fluorescencia y verifique que haya un haz de luz de color visible que se dirija al centro de la placa del escenario. Bajo luz blanca, centra las pupas en el campo de visión y enfócalas.
Apague la luz blanca y use el enfoque fino para enfocar el área de las pupas que llevan el fenotipo de interés con un patrón fluorescente visible. Use un pincel de detalle fino para girar suavemente las pupas y mueva las paletas anales para que se puedan identificar los genitales externos. Pupas separadas basadas en genitales externos distintivos.
Los machos tienen un tubo largo que extruye desde el segmento dorsal final aproximadamente la mitad de la longitud de las paletas anales. Los genitales externos de las pupas femeninas son considerablemente más cortos y bifurcados. Separe las pupas sexadas en grupos de 10 o menos en tubos transparentes de 20 mililitros con agua, y selle los tubos con una bola de algodón.
Aspire el número deseado de adultos machos y hembras de los tubos en una jaula o cubo pequeño, teniendo cuidado de no dañar a los adultos durante esta transferencia. Mantenga la cruz durante cinco a siete días antes de la alimentación con sangre. Al día siguiente, se pueden recolectar óvulos para estudiar el desarrollo embrionario.
Ensamble la cámara de oviposición e introduzca cuidadosamente de 10 a 15 hembras alimentadas con sangre en ella. Cubra la cámara de oviposición y deje actuar durante 20 minutos. Separe cuidadosamente el tubo de polipropileno de 50 mililitros de la olla de oviposición, asegurándose de no liberar a los mosquitos.
Cubra la maceta y permita que los huevos maduren hasta la etapa de desarrollo de interés. Recoge los huevos de la olla con un pincel de detalles finos y colócalos sobre el agua en un bloque de vidrio excavado de 40 milímetros cuadrados. Retire cuidadosamente el agua del bloque de vidrio con una micropipeta y cubra los huevos en 500 microlitros de FAA.
Oscile suavemente sobre el agitador orbital a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague bien los huevos 15 veces con agua destilada para eliminar todos los rastros de solución FAA. Usando una micropipeta de 1000 microlitros agregue y luego retire un mililitro de agua destilada a la vez, teniendo cuidado de no dañar los huevos mientras lo hace.
Cubra los huevos fijos con un mililitro de solución de Trpis e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los huevos comenzarán a desarrollar parches pálidos después de cinco minutos de incubación, alcanzando finalmente un color blanco lechoso una vez despejados. Enjuague bien los huevos 15 veces con agua destilada para eliminar todos los rastros de solución de Trpis.
La expresión de marcadores fluorescentes impulsados por el promotor 3xP3 se observa en los ojos y ganglios ventrales de las pupas de Anopheles gambiae. El uso de marcadores fluorescentes de diferentes colores permite la selección y detección de individuos modificados que llevan diferentes componentes GAL4 y UAS. Cuando se trabaja con un sistema BIPARTITO GAL4-UAS, es necesario cruzar machos y hembras de diferentes cepas para adquirir progenie llevando tanto los componentes GAL4 como UAS.
La morfología diferencial observada en el genital externo masculino y femenino de las pupas se utiliza para el sexado. Aquí se destaca un ejemplo de una pupa no identificable. La eliminación de toda el agua de las pupas, como se muestra a la derecha, aumenta la dificultad de sexado ya que las paletas anales oscurecen la visualización de los genitales.
El sistema bipartito GAL4-UAS permite la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada. Esto se puede visualizar cruzando el enocito y el omnipresente GAL4 cuatro líneas de conductor que expresan con la línea de respuesta UAS-mCherry. Un beneficio clave del uso de un sistema bipartito GAL4-UAS es la facilidad de estudiar fenotipos letales incluso en la etapa embrionaria.
Para ello, es necesario visualizar la morfología interna de los embriones. Las características morfológicas normales observadas en diferentes etapas del desarrollo embrionario a las 12, 24 y 36 horas después de la puesta se pueden ver después de la finalización del protocolo de limpieza embrionaria. Es vital a lo largo de este procedimiento que no se permita que las pupas y los huevos se desecan.
Por lo tanto, es importante trabajar rápidamente al eliminar líquidos. El método GAL4-UAS nos ha permitido caracterizar funcionalmente genes implicados en la resistencia a los insecticidas y aquellos con usos potenciales en los métodos de control de impulsores genéticos.
