Name: metagenomic analysis of silage
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
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Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Localización del Sitio <ol><li> Recoger la muestra de ensilaje de un sitio apropiado, tal como una granja. Aquí, la finca se encuentra en Ballydulea, Co. Cork, Irlanda (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. Extracción de ADN NOTA: la extracción de ADN se realizó utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Un control negativo, que no contenía la muestra, se utiliza en todo el método de preparación de la biblioteca. <ol><li> Añadir 100 a 400 mg de la muestra a un tampón de fosfato de sodio 978 l de tampón de lisis y suelo 122 l en los tubos de lisis suministrados. </li><li> Homogeneizar las muestras mediante la colocación de los tubos de lisis en el homogeneizador durante 40 s a una velocidad de 6.0 m / s. </li><li> lisados ​​centrifugar a 14.000 xg durante 15 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio que contenía 250 l de proteína precipitado de la solución (PPS). Mezclar la solución invirtiendo 10 veces y centrifugara 14.000 xg durante 5 min. </li><li> Añadir el sobrenadante a 1 ml de matriz de unión a ADN en un tubo de centrífuga limpio de 15 ml. Mezclar la solución invirtiendo el tubo constantemente por 3 min. Dejar que la mezcla se asiente durante 3 minutos, luego descarta 500 l de sobrenadante. Mezclar el sobrenadante restante. </li><li> Transferir 600 l de la suspensión a un filtro de giro y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min. Desechar el filtrado y se repite el proceso con el resto de la suspensión. </li><li> Añadir 500 l de tampón de lavado a la matriz de unión al ADN dentro del filtro giratorio, mezclar con la pipeta y centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. </li><li> Desechar el filtrado y centrifugar el filtro de centrifugado de nuevo a 14.000 xg durante 2 min para asegurar se haya eliminado todo el tampón de lavado. Secar el filtro giratorio a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Pre-caliente (70 ° C) el agua libre de DNasa (DES) y volver a suspender la matriz de unión de ADN en 100 L de DES en el filtro giratorio. Transferir el filtro giratorio a una limpia 1,5 ml de microcentrífuga maser y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min para eluir el ADN. Almacenar el ADN purificado a -20 ° C hasta que se realice un análisis posterior. </li></ol> 3. Perlas de purificación utilizando ADN Purificación de ADN Se obtuvo Antes de la preparación biblioteca metagenómica se purificó el ADN extraído usando perlas de purificación para asegurar una muestra de ADN puro: NOTA. <ol><li> Se incuban las perlas a 23ºC durante 30 min antes de su uso. Añadir 2 volúmenes de perlas para la muestra de ADN e incubar la solución a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Colocar las muestras en un imán de separación para 5 min y luego descartar el sobrenadante. Lavar las perlas dos veces con 200 l de etanol fresco 80% (EtOH). Deje secar al aire las perlas durante 10 minutos. </li><li> Eliminar las muestras del imán separación y añadir 50 l de tampón de elución (EB), mezclar mediante pipeteo. </li><li> Incubar la suspensión a 23 ° C durante 5 min, después de lo cual Colocar las muestras de nuevo en el imán de separación para 3 min. </li><li> Transfer el sobrenadante, que contiene el ADN, a un tubo limpio. Desechar las cuentas. </li><li> Cuantificar el ADN purificado de acuerdo con el apartado cuarto. </li></ol> 4. Cuantificación de ADN purificado NOTA: El ADN purificado se cuantificó usando un fluorómetro y kit de ensayo de doble cadena (dsDNA) de alta sensibilidad (HS) siguiendo las instrucciones del fabricante. <ol><li> Preparar una solución de trabajo utilizando 199: 1 relación de tampón y el agente reactivo. </li><li> Añadir 10 l de cada estándar de ADN de 190 l de solución de trabajo. </li><li> Añadir 10 l de ADN purificado a 190 l de solución de trabajo. El volumen final debe ser de 200 l. Incubar las muestras estándar y de ADN a 23 ° C durante 2 min. </li><li> Analizar las normas antes de las muestras de ADN en el fluorómetro utilizando las instrucciones que aparecen en pantalla. </li></ol> 5. La secuenciación escopeta Biblioteca Preparación NOTA: La biblioteca de escopeta secuenciación se preparó usando unkit de preparación de la biblioteca comercial usando las instrucciones del fabricante. <ol><li> Diluir las muestras de ADN a 0,2 ng / l utilizando EB. Cualquier muestra que ya está por debajo de esta concentración, es decir, el control negativo, se deja a su concentración actual. </li><li> Mezclar 5 l de ADN purificado con 10 l de tampón y 5 l mezcla de enzima. Incubar las muestras a 55ºC durante 5 min. </li><li> Añadir 5 l de tampón de neutralización y se incuba la solución a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Añadir 5 l de cada uno de los índices de secuenciación específicos de muestra y 15 l de la mezcla de PCR master. </li><li> En un termociclador, se incuban las muestras a 72 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 30 s, antes de los 12 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55ºC durante 30 s y 72 ° C durante 30 s. Incubar las muestras finalmente a 72 ° C durante 5 min. </li><li> Se purifica el ADN preparado mediante la purificación de talón como antes, pero con una elución final de 30 l de EB. </li></ol> 6. LCantidad ibrary y comprobación de la calidad NOTA: La cantidad y calidad de las bibliotecas preparadas se evaluaron utilizando un kit comercial y la instrumentación. <ol><li> Incubar los componentes del kit a 23 ° C durante 30 min antes de su uso. </li><li> Añadir 2 l de ADN a 2 l de tampón y de vórtice durante 1 min a 2000 rpm. </li><li> Centrifugar la muestra para asegurarse de que está en el fondo del tubo. </li><li> Inserte los tubos de muestra, cinta de análisis y consejos en el instrumento, y llevar a cabo análisis de la manera indicada por el software. </li></ol> La secuenciación de ADN 7. <ol><li> La transferencia de las bibliotecas de secuenciación de ADN preparados y cuantificadas las muestras a un servicio de secuenciación y la secuencia de 300 pb utilizando la secuencia final emparejado 45. </li></ol> 8. Análisis de los datos brutos de Secuencia NOTA: Los comandos para cada programa que usa un sistema operativo Linux se muestran a continuación de la etapa de protocolo. La tubería utilizada para sanálisis de los datos equence se muestra en la Figura 1. Los programas son para ser instalado por el usuario antes del análisis. Este proceso se debe realizar de forma individual para cada muestra. <ol><li> Analizar y visualizar los datos de la secuencia de ADN utilizando FastQC 46 escribiendo en la línea de comandos / ruta-a-archivo / fastqc, seguido por el avance y retroceso en bruto lee raw_read2.fastq raw_read1.fastq. </li><li> Especificar una carpeta de salida escribiendo output_fastqc -o y el formato de archivo de los archivos de lectura primas por FASTQ -f. </li><li> Ver el archivo de salida (Figura 2). ruta-a-archivo / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o -f output_directory FASTQ. </li></ol> 9. Control de Calidad del recorte y filtrado Datos de Secuencia <ol><li> Ejecutar el programa de recorte, Trimmomatic 28 escribiendo en la línea de comandos java-jar / ruta-a-archivo / trimmomatic-0.35.jar. </li><li> Especificar los archivos están emparejados archivos finales escribiendo &#39;PE&#39;. Estado que el 16 pr centroocessing unidades (CPU) deben ser utilizados por el programa escribiendo -threads 16. </li><li> Enumerar los dos archivos a verificación de control de calidad, escribiendo los nombres de la prima hacia adelante y marcha atrás lee. El prefijo de los archivos de salida se determina escribiendo ensilado -baseout. </li><li> Definir las opciones para el programa escribiendo ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 principales: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 CULTIVO: 200 HEADCROP: 15 minlen: 36. </li><li> Una vez completa, analizar las secuencias recortadas utilizando FastQC como antes y comparar la salida de la secuencia de datos en bruto para asegurar el recorte se ha realizado con éxito. NOTA: La herramienta de software, Trimmomatic, recortado lee más mediante la eliminación conduce baja calidad o N bases (por debajo de la calidad 3), la eliminación de arrastre de baja calidad o N bases (por debajo de la calidad 3) y analizando cada lectura con un 4-base amplia ventana deslizante. Los parámetros se establecieron para el corte cuando la calidad promedio por la base cae por debajo de 20 y luego a soltar cualquier lecturas por debajo de 36 bases de largo. Por último, 15 bases fueron cosechadas from la cabeza de cada uno lee y dice estaban recortada para mantener 200 bases desde el inicio de la lectura. Este último paso se llevó a cabo para superar algunos problemas de calidad durante la secuenciación de largo (&gt; 200 pb) lee. Estos se pueden ajustar para las muestras específicas 28. java-jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq ensilado -baseout ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 principales: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 CULTIVO: 200 HEADCROP: 15 minlen: 36 </li></ol> 10. Asamblea Metagenoma <ol><li> Combinar la desapareado, recortado lee escribiendo gato seguido por el desapareado lee; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Escribir los archivos a un nuevo archivo escribiendo&gt; silage_merged_unpaired.fastq gato silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Para novo ensamblar el ADN secuenciado, utilice Picas (San Petersburgo genoma ensamblador) 30 escribiendo / ruta-a-file / spades.py. Especificar que 16 CPU se van a utilizar escribiendo -t 16 y que el parámetro metagenomic debe aplicarse escribiendo --meta. </li><li> Identificar los recortado hacia adelante lee usando -1 silage_read1_paired.fastq y el reverso se lee por -2 silage_read2_paired.fastq. El desapareado fusionada lee son especificados por silage_merged_unpaired.fastq -s. </li><li> Definir la carpeta de salida escribiendo -o silage_spades. ruta-a-archivo / spades.py -t 16 --meta -1 -2 silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11.-extremo emparejado Lee Superposición <ol><li> Mezcla pares de secuencia de ADN lee el uso de flash (Rápido Ajuste de la longitud de la Corto lecturas) 29 escribiendo en la línea de comandos / ruta-a-archivo / flash. Especifican que 16 CPU deben ser utilizados mediante el uso -t 16 y el prefijo de salida escribiendo -o ensilado. </li><li> Identificar recortado lee escribiendo silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq ruta-a-archivo / flash-T16 -o FLASHED silage_read2_paired.fastq silage_read1_paired.fastq </li></ol> La clasificación taxonómica 12. <ol><li> Tipo / ruta-a-archivo / kraken y especifique la base de datos escribiendo --db / ruta-a-archivo / estándar. </li><li> Definir que 16 CPU se deben utilizar escribiendo --threads 16 e identificar una carpeta de salida mediante el uso de --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Escriba el nombre del archivo de entrada; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq ruta-a-archivo / norma --db kraken --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOTA: La clasificación de los andamios montados de secuencias de ADN utilizando Kraken 7 se completó en contra de la base de datos más reciente, Kraken estándar que contenía todas las secuencias del genoma procariotas disponibles. </li><li> columnas de transferencia 2 y 3 del archivo de salida y a un nuevo archivo escribiendo corte -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Abrir el archivo de salida en el navegador web. cortar -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importe el archivo nuevo en Corona 12 escribiendo ktImportTaxonomy. Especificar el archivo de entrada escribiendo FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Identificar el archivo de salida escribiendo -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html. ruta-a-archivo / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. anotación funcional <ol><li> Ir a la página web 47 MG-RAST, http://metagenomics.anl.gov/. Registrarse como nuevo usuario, si es necesario. Después de iniciar sesión, haz clic en el botón &quot;Subir&quot;. Sube los andamios montados desde el paso 10. </li><li> Una vez que los archivos se han cargado, haga clic en &quot;Enviar&quot; y siga las instrucciones y esperar a la finalización del análisis. </li><li> Después de terminado el análisis, ver el enlace enviado a través de EMail de MG-RAST, o, alternativamente, haga clic en &quot;Progreso&quot;. Hay una lista de los trabajos terminados. Haga clic en el identificador de trabajo pertinente y luego en el enlace a la &quot;página de descarga&quot;. </li><li> En la página de descarga, bajo el título &quot;La agrupación de proteínas del 90%&quot;, haga clic en el botón de proteínas para descargar el archivo de proteína predicha, 550.cluster.aa90.faa. </li><li> Para clasificar las proteínas que supuestamente pertenecen a una clase particular de enzimas CAZy, comparar las proteínas cargadas en la base de datos CAZy 48. Descargar la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy) a partir de archivos son: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip y PL.zip. Estos archivos representan las siguientes clases de enzimas, respectivamente: Actividades auxiliares (AA), esterasas de hidratos de carbono (CE), glucósido hidrolasas (GH), glicosil transferasas (GT) y el polisacárido liasas (PL). </li><li> Descomprimir los archivos de base de datos y anotar las proteínas mediante la determinación de la similitud de proteínas de las proteínas de bases de datos utilizando el Cazy Algor USEARCH UBLASTITHM 49. Para utilizar un bucle de bash (for i in * .txt) para iterar a través de la base de datos de tipo 5 archivos .txt &quot;for i in * .txt; hacer&quot;. </li><li> Ejecutar USEARCH escribiendo / ruta-a-archivo / usearch8 con el -ublast parámetro con el fin de utilizar el algoritmo ublast. A continuación, escriba el nombre del archivo de secuencias de proteínas descargado de MG-RAST, &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Para indicar el archivo de base de datos que se utilizará el tipo &quot;-db $ i&quot; y para especificar el E-valor umbral en 1e -5, tipo &quot;-evalue 1e-5&quot;. </li><li> Para terminar la búsqueda tras el descubrimiento de una secuencia diana y por lo tanto la clasificación de que la secuencia de proteínas como pertenecientes a la clase de la enzima diana, por ejemplo GH, tipo &quot;-masaccepts 1&quot;. </li><li> Para definir que 16 CPU deben utilizarse tipo &quot;-threads 16&quot; y para especificar el formato del archivo de salida como tipo &quot;-blast6out&quot; ATAB separados texto. Para identificar el tipo de archivo de salida &quot;$ i.ublast&quot;. Para terminar el bucle de bash, tipo &quot;; hecho&quot; for i in * .txt; hacer / ruta-a-archivo / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; hecho </li></ol> 14. Visualización CAZy Anotación <ol><li> Para visualizar la salida de la anotación CAZy como un diagrama de Venn, generar listas de ID de la proteína para cada clase de la enzima usando un bucle de bash. Tipo &quot;for i in * .ublast; hacer&quot;. </li><li> Para transferir la columna 1 del archivo de salida y en un nuevo archivo, tipo &quot;cat $ i | cortó -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Terminar el bucle y el tipo &quot;; hecho&quot;. </li><li> Abrir los archivos .list en un editor de texto. Ir a la página web, seleccione el número de series como 5 y pegar el contenido de cada archivo de lista en una caja separada. Descargar el diagrama resultante como un archivo .SVG. for i in * .ublast; hacer cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list; hecho </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mientras que un análisis in silico puede dar una excelente visión de las comunidades microbianas que están presentes en muestras ambientales, es fundamental que las clasificaciones taxonómicas demostraron ser realizado en asociación con los controles pertinentes y que una profundidad adecuada de la secuenciación se ha logrado captar la totalidad población actual 51. Con cualquier análisis computacional, hay muchas rutas para lograr un objetivo similar. Los métodos que hemos utilizado en este estudio son ejemplos de métodos adecuados y sencillos, que han sido reunidas para lograr una serie de análisis sobre el microbioma ensilado. Una variedad y un número cada vez mayor de herramientas y técnicas de bioinformática están disponibles para analizar los datos de metagenómica, por ejemplo Phylosift 8 y 52 MetaPhlAn2, y estos deben ser evaluados antes de la investigación por su importancia para la muestra y el análisis reqpedirá otra 53. métodos de análisis Metagenomic están limitados por las bases de datos disponibles para la clasificación, la profundidad de la secuenciación y la calidad de secuenciación. El tratamiento bioinformático ha demostrado aquí se llevó a cabo en una máquina motorizada locales, alta; Sin embargo los sistemas basados ​​en la nube también están disponibles. Estos servicios basados ​​en la nube permiten el alquiler de la potencia de cálculo necesaria sin tener la inversión de alto costo de una potente estación de trabajo local adecuado. Una posible aplicación de este método sería evaluar el ensilaje antes de su uso en la agricultura para asegurar que no hay bacterias potencialmente dañinas están presentes, por lo tanto evitando que entren en la cadena alimentaria.

La metagenómica es el análisis directo del ADN purificado a partir de las comunidades biológicas que se encuentran dentro de las muestras ambientales 1 y se utilizó originalmente para detectar bacterias no cultivables que se encuentran en los sedimentos 2. Metagenomics ha sido ampliamente utilizado para un número de aplicaciones, tales como la identificación de la microbioma humano 3, la clasificación de las poblaciones microbianas en el océano 4 e incluso para el análisis de las comunidades de bacterias que se desarrollan en las máquinas de café 5. La introducción de las tecnologías de secuenciación de próxima generación dio lugar a un mayor rendimiento de secuenciación y de salida. En consecuencia, la secuenciación del ADN se ha convertido en más económico 6 y la profundidad de secuenciación que puede ser realizado ha aumentado considerablemente, lo que permite la metagenómica para convertirse en una herramienta poderosa, analítica. Mejoras &quot;front-end&quot; en el aspecto práctico, molecular de secuenciación metagenómica han impulsado el crecimiento de la inherramientas bioinformáticas silico disponibles para la clasificación taxonómica 7-9, anotación funcional 10,11 y 12,13 representación visual de los datos de secuencia de ADN. El número cada vez mayor de disposición, secuenciado procariotas y eucariotas 14 genomas permite mayor precisión en la clasificación de las comunidades microbianas, que se realizan siempre en contra de una base de datos de referencia &quot;back-end&quot; de 15 genomas secuenciados. Dos enfoques principales pueden ser adoptados para el análisis de metagenómica. El método más convencional es el análisis del gen 16S rRNA región del genoma bacteriano que codifica. El 16S rRNA está altamente conservada entre las especies procariotas pero exhibe nueve regiones hiper-variable (V1 - V9) que puede ser explotada para la identificación de especies 16. La introducción de la secuencia más larga (≤ 300 pb extremo emparejado) permitido para el análisis de secuencias de ADN que abarcan dos regiones hipervariables, en particularV3 - V4 región 17. Los avances en las tecnologías de secuenciación de otros, tales como Oxford nanoporos 18 y 19 PacBio, permiten que todo el gen 16S rRNA para secuenciar de forma contigua. Aunque las bibliotecas basadas 16S rDNA proporcionan un enfoque dirigido a la identificación de especies y permiten la detección de ADN bajo número de copias que se produce de forma natural en muestras purificadas, las bibliotecas de secuenciación shotgun permiten la detección de especies que pueden contener regiones de ADN que, o bien no son amplificable por 16S secuencias de cebador rRNA marcador usado, o porque las diferencias entre la secuencia de la plantilla y la secuencia del cebador de amplificación son demasiado grandes 20,21. Además, aunque las ADN polimerasas tienen una alta fidelidad de la replicación de ADN, los errores de base pueden, no obstante, producirse durante la amplificación por PCR y estos errores incorporados pueden dar lugar a la clasificación incorrecta de las especies 22 de origen. Sesgos en la amplificación por PCR de la SEC plantillaTambién se pueden producir influencias; secuencias de ADN con un alto contenido de GC pueden estar bajo representado en la piscina amplicón final de 23 y de manera similar modificaciones de base no naturales, tales como glicol timina, puede detener ADN polimerasas causando fallos en la amplificación de secuencias de ADN 24. En contraste, una biblioteca de ADN secuenciación escopeta es una biblioteca de ADN que se ha preparado mediante el uso de todo el ADN purificado que ha sido extraído de una muestra y, posteriormente, fragmentado en longitudes de cadena de ADN más corto antes de la preparación para la secuenciación. Clasificación taxonómica de las secuencias de ADN generadas por secuenciación shotgun es más preciso en comparación con la secuenciación de ARNr 16S amplicón 25, aunque el coste financiero necesario para alcanzar una profundidad de secuenciación fiable es mayor que la de la secuencia de amplificación 26. El principal beneficio de la metagenómica secuenciación escopeta es que las regiones secuenciadas de los diferentes genomas en la muestra están disponibles para la prospección de genes una vez que han sidoha sido clasificada taxonómicamente 27. datos de la secuencia metagenómica es analizada por una cada vez mayor gama de herramientas bioinformáticas. Estas herramientas son capaces de realizar una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, análisis de control de calidad de los datos de secuencia en bruto 28, la superposición del extremo emparejado lee 29, de novo montaje de secuencia lee a contigs y andamios 30,31, clasificación taxonómica y la visualización de la secuencia lee y secuencias de 7,12,32,33 y la anotación funcional de las secuencias ensambladas 34,35 montado. El ensilaje, producida por los agricultores de todo el mundo a base de cereales fermentados, como el maíz (Zea mays), se utiliza principalmente como alimento para ganado. El ensilaje se trata con la bacteria Lactobacillus sp. para ayudar a la fermentación 36, pero hasta la fecha, existe un conocimiento limitado de las otras poblaciones de microbios que se encuentran en el ensilaje. el fermentation proceso puede conducir a los microorganismos indeseables y potencialmente dañinos va imponiendo en el ensilaje de 37. Además de levaduras y mohos, las bacterias son particularmente adaptable al entorno anaeróbica en la fermentación de ensilaje y están asociados más frecuentemente con enfermedades en el ganado en lugar de la degradación de la ensilaje 38. Pueden ser añadidos inadvertidamente del suelo bacterias ácido butírico se mantiene durante el llenado de los silos de ensilado y son capaces de convertir el ácido láctico, un producto de la digestión anaerobia, a ácido butírico, lo que aumenta el pH del ensilaje 39. Este aumento en el pH puede conducir a un aumento de las bacterias de descomposición que normalmente sería incapaz de sostener el crecimiento en condiciones de fermentación óptima de ensilado 38. Clostridium spp. , Listeria spp. y Bacillus spp. son de particular preocupación, especialmente en el ensilaje para la alimentación de ganado lechero, como esporas bacterianas que han sobrevivido a la gastrtracto ointestinal 40 puede entrar en la cadena alimentaria, conducir a la descomposición de los alimentos y, en casos raros, a los animales y muertes humanas 37,39,41-44. Por otra parte, si bien es difícil estimar el impacto económico exacto de tratamiento veterinario y la pérdida de ganado causada por el deterioro del ensilaje, es probable que sea perjudicial para una granja si un brote se iba a producir. La hipótesis es que mediante el uso de un enfoque metagenomic podemos clasificar las poblaciones microbianas que están presentes en muestras de ensilaje y además identificar las comunidades microbianas asociadas con el deterioro del ensilaje que, a su vez, lo que podría tener un efecto perjudicial sobre el ganado, lo que permite medidas correctoras necesarias tomado antes de que el ensilado es para ser utilizado como una fuente de alimento.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Antes del procesamiento bioinformático, la secuencia de bajo nivel Lee se recorta y los adaptadores se eliminan con el software Trimmomatic 28. Después de la etapa de recorte y de filtrar, el número de lecturas se redujo a 50% de la secuencia lee (Tabla 1). La puntuación media Phred base era&gt; 30 después del control de calidad (Figura 2). Pares de secuencias de ADN que tenían zonas de solapamiento se fusionaron usando el software Flash 29 para generar sola ya lee, no se solapan lee se mantuvieron en un archivo separado. 45.47% lee (105343) combinado con éxito. Tras la superposición de lee el uso de flash de lecturas, los fragmentos ampliados resultantes se sometieron a clasificación taxonómica bacteriana usando el software Kraken 7 y posteriormente se visualizaron con el software de Corona (Figura 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.Dentro-page = &quot;1&quot;&gt; La mayoría de las especies bacterianas presentes en el metagenoma ensilaje se encuentran dentro de 4 phyla procariota: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), Proteobacteria (27%) y Bacteroidetes (7%) . La distribución de las clases presentes dentro de estos filos se puede ver en la Figura 4. Las especies más abundantes en el metagenoma eran Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) y Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). También se observaron especies importantes para la salud animal y implicados en la enfermedad; Clostridium spp. (1%) Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) se prevé que ser presente en la muestra de ensilaje. Funcional anotación se realizó en montado lee. Metagenoma fue ensamblado usando el ensamblador Picas 30 mediante el recortado y filtradaemparejado-end y no apareado lee la generación de 92,284 andamios. Con el fin de identificar las celulasas, las proteínas se predijo a partir de MG-RAST y anotaron utilizando la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy). De los 97,562 proteínas predichas, 6357 fueron anotados como una enzima de hidratos de carbono activo putativo en una de las cinco clases de enzimas que conforman la base de datos CAZy (Figura 5). Los resultados se visualizan como un diagrama de Venn usando software InteractiVenn 50 que muestra la distribución de las anotaciones de proteínas, incluyendo los que contienen más de una clase de enzimas anotación CAZy. De estos, 3861 se predice que tienen actividad hidrolasa de glucósido y se va a caracterizar aún más en el laboratorio para confirmar la función. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Figura 1: La metagenómica bioinformático de la tubería de Análisis para el ensilaje. Dos enfoques principales eranutilizado para investigar el microbioma del ensilaje, clasificación taxonómica y la anotación funcional. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Figura 2: Calidad de secuencia por la base antes y después del recorte y la eliminación del adaptador. La secuencia de trama por la calidad de la base de FASTQC muestra la puntuación media Phred través de la longitud de la secuencia de control lee antes y después de la calidad. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Figura 3: taxonómica Classificación del microbioma bacteriana de ensilaje sólido. Clasificación de la secuencia de superposición recortado y lee de la memoria flash se ha realizado mediante Kraken 7 y posteriormente se visualiza con corona. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Figura 4: Distribución taxonómica de la Clase 4 Phyla más abundante en el microbioma bacteriana de ensilaje sólido. El porcentaje de cada clase de bacterias dentro de los cuatro filos más abundante. Firmicutes: clostridios (rojo) y bacilos (azul oscuro); Proteobacterias: delta / épsilon (rosa), alfa (azul claro), gamma (naranja) y beta (turquesa); Bacteroidetes: flavobacteria (azul oscuro) y Bacteroidia(Verde pálido); Actinobacteria: Coriobacteriia (púrpura oscura) y otra actinobacteria (verde oscuro). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Figura 5: CAZy anotación del proteoma previsto en el Ensilaje sólido microbioma. diagrama de Venn que muestra la distribución de las cinco clases de enzimas de anotaciones CAZY en el proteoma predicho de microbioma ensilaje sólido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw lee </td><td rowspan="2"> # Filtrada lee (emparejado) </td&gt; <td> # Filtrada lee </td><td rowspan="2"> # FLASHED lee </td></tr><tr><td> (Emparejado) </td><td> (Sin pareja) </td></tr><tr><td> 2374949 x2 </td><td> 231679 x2 </td><td> 1,892,534 </td><td> 105.343 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Tabla resumen de las lecturas de secuenciación.

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Análisis metagenomic de ensilaje

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

18.1K vistas.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

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Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Investigación

Medio ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Genética

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Evaluación del impacto de la fracturación hidráulica en las corrientes utilizando firmas moleculares microbianas

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biología

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un híbrido método de extracción de ADN para la Evaluación de las comunidades bacterianas cualitativa y cuantitativa de Aves de Corral en muestras de producción

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Análisis metagenomic de ensilaje

Resumen

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